应用于分子标记检测油菜杂交种纯度的DNA批量获取方法与流程

本发明涉及植物生物技术领域，具体地指一种应用于分子标记检测油菜杂交种纯度的dna批量获取方法。

背景技术：

油菜是典型的异花授粉作物，杂种优势强，目前我国大部分油菜种植区所种植的油菜品种多为杂交种。油菜杂交品种在出售前，都要进行严格的纯度鉴定。随着生物技术的不断发展，分子标记检测手段越来越多的被使用到油菜杂交种纯度鉴定中来。由于油菜种子较小，而纯度鉴定需要单粒确定基因型杂合度，因此油菜杂交种纯度鉴定需要的样品数量相对较大。由于目前尚无法实现低成本批量获取油菜单粒干种子dna，因此分子标记检测油菜杂交种纯度一般分两个步骤，

第一步种子发芽，获取单粒种子子叶样本

第二步子叶dna提取检测。

虽然目前提取dna的方法有多种，但都无法避免人工单个子叶取样，并分装至离心管的环节。由于此环节主要由人工手动完成，所以大大降低了dna获取的效率，无法快速、批量和低成本的获取dna。本发明通过油菜种子深孔板内发芽的方法，成功实现种子发芽与dna提取过程的无缝对接，不但显著提高了获取dna的效率，同时也节约了人力和物力，压缩了实验成本。同时在此基础之上，本发明进一步简化现有碱裂解法提取dna步骤，且配合fast&fluidmanagement样品混匀仪的使用，成功实现了万份dna样品提取10小时内完成。该发明是快速批量低成本获取油菜子叶dna样品的一整套集约化方案，通过本发明的应用可以大大提高获取用于分子标记鉴定油菜杂交种纯度的dna的效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种应用于分子标记检测油菜杂交种纯度的dna批量获取方法。该方法能够快速批量低成本获取样品dna。

为实现上述目的，本发明提供的一种应用于分子标记检测油菜杂交种纯度的dna批量获取方法，包括以下步骤：

1)首先配置琼脂糖凝胶并冷却至室温，得到粘稠液态状的琼脂糖凝胶，然后向深孔板(规格：2ml)的每个小孔内加入粘稠液态状的琼脂糖凝胶；

2)将待检测的油菜杂交种单粒播种于含有琼脂糖凝胶的小孔中，即每孔一粒种子，然后将深孔板置于培养箱中进行培养4～7天；

3)待孔内油菜子叶展开(2片子叶呈60～180°展开)，每孔内加入钢珠一枚；

4)之后再向每孔中加入naoh溶液，将深孔板置于水浴锅中水浴加热；

5)水浴后深孔板加盖乳胶封口膜，通过fast&fluidmanagement样品混匀仪对深孔板中的杂交种子叶样品进行高速研磨；

6)将研磨好的深孔板取出，打开封口膜，向研磨后的小孔内加入tris-hcl溶液，离心取上清即为样品dna。

进一步地，所述步骤1)中，琼脂糖凝胶浓度为1～2g/l

再进一步地，所述步骤1)中，每个孔中琼脂糖凝胶添加量为0.1～0.2ml。

再进一步地，所述步骤2)中，培养过程中，首先进行24h的暗培养，然后进行正常的生理光照。

再进一步地，所述步骤2)中，正常的生理光照为光照培养和无光照培养交替进行，光照时间为16h，无光照时间为8h。

再进一步地，所述步骤3)中，钢珠直径为0.2～0.6cm，水浴温度为95～98℃，时间为2～5分钟。

再进一步地，所述步骤4)中，naoh溶液浓度为0.20～0.40mol/l，优选为0.25。

再进一步地，所述步骤5)中，使用fast&fluidmanagement样品混匀仪对深孔板中的杂交种子叶样品进行高速研磨

再进一步地，所述步骤6)中，tris-hcl溶液浓度0.1mol/l，其添加量为0.3～0.6ml。

本发明的有益效果在于：

1)本发明是从杂交种纯度鉴定的整个过程入手，对种子发芽及后期样品dna提取都进行了技术创新和改进，而现有技术大多只针对dna提取过程做出优化和改进，没有涉足先期种子发芽育苗过程。

2)本发明中油菜杂交种子叶深孔板内培养技术，实现从发芽到样品提取板内一次完成。这一技术创新将有效简化dna获取过程中育苗期的人工管理环节及实验耗材的使用，有效降低了成本，提高了实验效率。

3)本发明进一步简化现有碱裂解法的操作步骤，只需两种实验试剂便可完成dna提取工作，平均到每个样品中试剂成本不足0.1元。

4)本发明中fast&fluidmanagement样品混匀仪的使用，超500份样品1次研磨，且研磨时间仅为2～3分钟，使得10小时完成万份dna样品的提取成为可能，大大提高了dna提取的速度，增加了提取数量。

5)本发明操作简单，无需专业技术人员，dna获取成本低，数量大效率高，非常适合市场化推广应用

附图说明

图1为油菜杂交种子叶深孔板培养图

图2为ssr分子标记检测油菜杂交种纯度6％变性胶垂直板电泳图，箭头为非杂合单株，大括号下为父母本对照

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

油菜杂交种云油杂3号的2个批次的杂交种纯度鉴定

1)样品发芽准备：首先配置浓度为1～2g/l琼脂糖凝胶，冷却后(由于凝胶浓度较低，呈现粘稠液态状)利用连续加样器分装至深孔板中(规格：96孔)，每孔加0.1ml。待所需深孔板全部分装完毕后(一般以8个深孔板为一组)，将需纯度鉴定的油菜杂交种云油杂3号种子用镊子单粒播于每个深孔板的单孔中。

2)样品生长培养：将包含种子的深孔板，置于光照培养箱中进行培养，先进行24小时的暗培养处理，以利于种子的萌发。待种子出芽后，则进行正常的生理光照处理(16h/光照，8h/无光照)(图1)。当油菜种子在培养箱中生长时，定期查看其生长状况，待子叶展开时即可进行dna提取工作。(一般需要5天左右的时间，材料不同可能生长速度存在差异)

3)样品dna批量提取：

a)分别配置浓度为0.25mol/lnaoh溶液及浓度为0.1mol/l的tris-hcl溶液各适量(依据实验用量而定)。

b)利用置珠器分别加直径为0.5cm钢珠于深孔板的每孔中，每孔加钢珠一颗。

c)之后利用连续加样器在每孔中加入0.1ml的naoh(0.25mol/l)，将加有钢珠的生孔板置于95℃水浴锅中水浴2～5分钟，取出后加盖乳胶封口膜。

d)将加盖好乳胶封口膜的深孔板置于fast&fluidmanagement样品混匀仪中进行样品研磨，时间设定为3分钟。

e)将研磨好的深孔板取出，打开封口膜，利用连续分装器在每孔中加入0.1mol/l的tris-hcl0.3ml。

f)将深孔板(每次4个)对称置于eppendorfag22331hamburg(型号：0034546)高速平板离心机，4000rpm离心2～5分钟，轻轻取出。

g)离心好的深孔板其上清液可直接用于后期pcr扩增，吸取上清即为样品dna。每批次可以获得768个样品，每批次dna提取时间约费时40～60分钟。

4扩增检测

a)按以下pcr体系扩增：50ngdna，1×pcr缓冲液，2.0mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps，0.5utaq酶，正向及反向ssr引物各12.5ng，反应总体积为10μl。pcr循环参数为：94℃(2min)；94℃(30s)，60℃(-0.5℃/循环)(30s)，72℃(45s)，9个循环；94℃(30s)，55℃(30s)，72℃(1min)，30个循环；4℃保存。

b)电泳检测:扩增产物于6％变性page凝胶上电泳分离，通常用0.5×tbe，80w电压。电泳完成后，银染法显带，用数码相机拍照保存图片(见图2)。

从图2中可以得出在所检测的100个样品中，共计有7个纯和基因型单株，由此计算出杂合基因型比率为93％(即纯度为93％)。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。