本发明属于生物技术领域，涉及一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体及其扩培方法。
背景技术：
目前控制、消除致病菌的主要手段仍是各种物理或化学的方法，包括各种抗生素的使用。物理或化学的方法都存在着明显的弊端。首先，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，不能实现整个领域所有环节的应用，其次，化学方法中的酸碱处理虽可以取得一定防治效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就极不理想；最后，抗生素虽然开始使用效果显著，但是长期使用，不仅会增强病原菌的抗药性，而且抑制有益菌群，最终不能有效地控制、消除致病菌。
近年来，微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是噬菌体的研究受到人们的青睐。噬菌体自1896年被发现以来，因其高效裂解其宿主，且对人和动物无害，而备受关注。噬菌体是一种细菌病毒，它能够对宿主细菌产生特异性的裂解作用，并在细菌培养板上形成空斑，因而将其命名为噬菌体。噬菌体分为温和噬菌体和烈性噬菌体，其中烈性噬菌体对宿主菌具有很强的裂解效率，其复制效率和繁殖能力远远高于宿主菌；烈性噬菌体在宿主菌内能稳定增殖后，一个噬菌体颗粒能够杀死数亿个宿主菌。噬菌体效价(滴度)是单位体积内(ml)内有的噬菌体个数。由于噬菌体对宿主菌的高效裂解能力，用于治疗细菌感染，特别是治疗耐药细菌感染的噬菌体制剂的研究已经成为国内外研究的热点之一，受到越来越多的生物技术公司和研究机构的重视。
专利号为cn200910038392.x名称为一种分离的副溶血弧菌噬菌体及其在杀菌和防菌中的应用的国家发明专利公开了一种分离的副溶血弧菌噬菌体(vibrioparahaemolyticus)及其在杀菌和防菌中的应用。分离出的噬菌体单体命名为bph-vp-1，对副溶血弧菌具有广谱的杀菌能力。
专利申请号为201510872234.x名称为一种副溶血弧菌噬菌体及其制备方法和应用涉及一种副溶血弧菌噬菌体及其作为生物杀菌剂在食品及水产品养殖环境中的杀菌应用。分离的副溶血弧菌噬菌体，保藏号cctccm2015577，对副溶血弧菌具有高效的裂解活性，其分离培养物及复配制剂能够作为食品添加剂或环境消毒剂防控食品中副溶血弧菌的污染。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体及其扩培方法，具有噬菌体裂解性强的特点，该噬菌体具有杀菌速度快、产量高的特点，同时在发酵结束时，对发酵液进行固液分离，避免了副溶血弧菌对环境的危害。
该噬菌体的保藏单位代码为cctcc-中国典型培养物保藏中心,中国典型培养物保藏中心地址为：武汉市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年12月9日，保藏编号为cctccno：m2016740，保藏检测结果为存活，名称为副溶血弧菌噬菌体vp11，分类命名为vibrioparahaemolyticusbacteriophagevp11。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体，其特征在于包括如下步骤：
步骤a：宿主菌的分离纯化，本发明的副溶血弧菌从大量南美白对虾的病虾肠道中分离获得；
步骤b：宿主菌的扩大培养，在nb或lb液体培养基中加入1-5％的nacl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温，采用如下两种接种方法，第一种接种方法是单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，发酵温度为28-35℃，转速为50-200rpm，发酵时间14-18h；第二种接种方法是液体接种，加入培养基体积10-20％的cfu为106-108pfu/ml的副溶血弧菌菌液至nb液体培养基中进行发酵，发酵温度为28-35℃，转速为50-200rpm，发酵时间10-16h；
步骤c：噬菌体分离，从大量海水中分离获得；
步骤d：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培；
步骤e：将所得的发酵液，在2-10℃下1000-8000rpm离心5-20min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，即得噬菌体微生态制剂，其效价为1010-1012pfu/ml；
步骤f：噬菌体用于防治对虾副溶血弧菌病的裂解生长曲线测定；
步骤g：南美白对虾攻毒实验，取大小规格为50尾/斤的健康南美白对虾，每缸60尾，分别养殖在15个玻璃缸内，其中9个为实验缸，分为a、b、c组；剩余6个为对照缸，分为阴性对照d和空白对照e组，每组3个重复，每个玻璃缸内加120l盐度为25的海水；对虾染病的方法采用浸泡感染，即在28℃条件下，使用步骤b发酵好的副溶血弧菌菌液，根据菌液浓度和玻璃缸体积计算出每组需要加入菌液的体积，分别加入a、b、c和阴性对照d组，最终使玻璃缸内水体含菌量达1×108cfu/ml，对照e组不做任何处理，3组实验箱内分别加噬菌体1×105pfu/ml、1×104pfu/ml、1×103pfu/ml，a组、b组、c组，记录南美白对虾死亡情况。
优选的，所述步骤b中副溶血弧菌为对虾强致病菌，单菌落接种发酵时间14-18h；第二种接种方法的接种菌液cfu为106-108之间，接种比例10-20％，发酵时间10-16h。
优选的，所述步骤d中用于接种噬菌体的pfu为104-108pfu/ml，接种体积为发酵液体积的1-20％之间。
优选的，所述步骤d中扩培条件为温度为28～37℃，转速为50～200rpm；
优选的，扩大培养时间控制在8-12h之间。
优选的，所述步骤e中，在2～10℃温度下1000-8000rpm离心5～20min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，即得噬菌体生态制剂，其效价为1010～1012pfu/ml。
一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体的扩培方法，应用一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体，噬菌体的扩培是将1-20％的pfu为104-108pfu/ml噬菌体加到上述发酵好的副溶血弧菌发酵液中，发酵温度28-37℃，转速50-200rpm，发酵时间8-12h。
本发明的优点在于：本发明利用南美白对虾感染的副溶血弧菌在海水中分离得到一株强裂解性噬菌体，该噬菌体产量高(其效价为达1010-1012pfu/ml)，发酵周期短(8-12h)，对于治疗副溶血弧菌引起的病害具有重大意义。该噬菌体命名为vp11，保藏于中国典型培养物保藏中心cctcc，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年12月9日，保藏编号为cctccno：m2016740。具有如下优点：1.分离的噬菌体能够高效价裂解副溶血弧菌，具有靶向特异杀菌、长期持续作用、对环境安全等特点；2.生长周期短，培养基简单，成本低，产量高；3.采用噬菌体处理养殖用水，相对于抗生素，具有不污染水质、避免耐药菌株产生且成本低廉的优势；4.可以用于治疗对虾养殖过程中副溶血弧菌引起的病害，促进对虾养殖的丰产和丰收；5.在发酵结束时，对发酵液进行固液分离，避免了副溶血弧菌对环境的危害。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细的描述。
图1是本发明用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体及其扩培方法中噬菌体一步生长曲线图。
具体实施方式
本发明的用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体包括如下步骤：步骤a：宿主菌的分离纯化，本发明的副溶血弧菌从大量南美白对虾的病虾肠道中分离获得。步骤b：宿主菌的扩大培养，在nb或lb液体培养基中加入1-5％的nacl，121℃高压灭菌20min，冷却至室温。有两种接种方法：一是单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，发酵温度为28-35℃，转速为50-200rpm，发酵时间14-18h；二是液体接种，加入培养基体积10-20％的cfu为106-108pfu/ml的副溶血弧菌菌液至nb液体培养基中进行发酵，发酵温度为28-35℃，转速为50-200rpm，发酵时间10-16h；步骤c：噬菌体分离，从大量海水中分离获得。步骤d：噬菌体扩培，对分离出来的噬菌体进行扩培。步骤e：将所得的发酵液，在2-10℃下1000-8000rpm离心5-20min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，即得噬菌体微生态制剂，其效价为1010-1012pfu/ml。步骤f：噬菌体用于防治对虾副溶血弧菌病的裂解生长曲线测定，见表1。步骤g：南美白对虾攻毒实验，取大小规格为50尾/斤的健康南美白对虾，每缸60尾，分别养殖在15个玻璃缸内，其中9个为实验缸，分为a、b、c组；剩余6个为对照缸，分为阴性对照d和空白对照e组，每组3个重复，每个玻璃缸内加120l盐度为25的海水。对虾染病的方法采用浸泡感染，即在28℃条件下，使用步骤b发酵好的副溶血弧菌菌液，根据菌液浓度和玻璃缸体积计算出每组需要加入菌液的体积，分别加入a、b、c和阴性对照d组，最终使玻璃缸内水体含菌量达1×108cfu/ml，对照e组不做任何处理，3组实验箱内分别加噬菌体1×105pfu/ml(a组)、1×104pfu/ml(b组)、1×103pfu/ml(c组)，记录南美白对虾死亡情况。结果，见表1，发现：未施加噬菌体的阴性对照组d，对虾72h内全部死亡，而实验组发病对虾症状较轻；噬菌体使用浓度越高，对虾的发病程度越轻，存活率就越高，实验组存活率达到85％以上。
表1噬菌体防治南美白对虾副溶血弧菌病的攻毒实验结果(72h)
本发明利用南美白对虾感染的副溶血弧菌在海水中分离出一株强裂解性噬菌体，该噬菌体发酵后效价达1010-1012pfu/ml，发酵周期为8-12h。具有如下优点：分离的噬菌体能够高效价裂解性噬菌体，具有靶向特异杀菌、长期持续作用、对环境安全等特点；发酵周期短，培养基简单，成本低，产量高；采用噬菌体处理养殖用水，相对于抗生素，具有不污染水质、避免耐药菌株产生且成本低廉的优势；可以用于治疗对虾养殖过程中副溶血弧菌引起的病害，促进对虾养殖的丰产和丰收；在发酵结束时，对发酵液进行固液分离，避免了副溶血弧菌对环境的危害。
用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体的检测，采用上述的用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体，采用点滴法将过夜培养的副溶血弧菌均匀涂布于lb平板，待平板干透，滴加20-50ul的扩培液，保持环境温度28-37℃并静置培养8-18小时，观察有无噬菌斑出现；采用双层平板法，将凝固的nb或lb半固体培养基加热至完全融化，待温度降至45℃时，加入培养至对数期的副溶血弧菌0.2ml和富集液0.1ml，倒入lb平板上层，待凝固后，于28-37℃培养8-18小时，观察有无噬菌斑出现；若采用上述的点滴法和双层平板法两种方法检测结果均呈阳性，则证明存在噬菌体。
用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体的效价鉴定，基于用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体的检测，将噬菌体滤液连续十倍倍比稀释，采用双层平板法培养过夜，接着统计噬菌斑个数，噬菌斑个数以每na或lb平板30-300个为准确，实验需要重复三次，取三次的平均值为最终噬菌体的效价，其中，效价换算公式为：噬菌体效价＝噬菌斑个数3*稀释倍数/加入的噬菌体滤液体积。效价鉴定过程中若每na或lb平板的噬菌斑个数若成倍大于或者成倍小于每na或lb平板30-300个，则需成倍增加或者成倍减少噬菌体滤液稀释倍数。
一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体的扩培方法，应用一株用于防治对虾副溶血弧菌病的噬菌体，噬菌体的扩培是将1-20％的pfu为104-108pfu/ml噬菌体加到上述发酵好的副溶血弧菌发酵液中，发酵温度28-37℃，转速50-200rpm，发酵时间8-12h。
如图1所示的噬菌体一步生长曲线，将噬菌体接种于宿主菌菌悬液中，取时间0，25，50，75，100，125，150，175，200，720，1440min，利用双层板法，进行噬菌体数量检测，得到噬菌体一步生长曲线。结果表明，噬菌体vp11对于副溶血弧菌vp11裂解性能强，具有极强的杀弧菌能力，可达1010pfu/ml以上。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制性技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。