一种重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌的高密度发酵方法与流程

本发明涉及微生物发酵领域，特别涉及一种牛粒细胞集落刺激因子工程菌的高密度发酵方法。

背景技术：

随着分子生物学技术的迅速发展，许多有重要应用价值却又难以直接合成的蛋白质已经在多种表达系统中得到表达。在众多的基因工程表达系统中，由于大肠杆菌(escherichiacoli)结构简单、遗传学背景清晰、容易培养、生长周期短，生长条件清楚，成为最常用的宿主菌，目前已成为最为常用的原核表达系统，许多有价值的重组蛋白都在大肠杆菌中获得了表达。

利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其构建的基因工程菌的表达产物，大肠杆菌的生物量、蛋白表达量、代谢产物在菌体内和发酵液中的浓度都比较低，难以获得理想的生产效率。近年来，随着大肠杆菌基因重组技术与大肠杆菌高密度发酵技术的结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能够大量生产，如集落刺激因子、干扰素、氨基酸等的生产。

高细胞密度发酵(highcelldensitycultivation，hcdc)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。实现高密度发酵不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。

重组大肠杆菌进行高密度发酵可获得较高的生物量，但对发酵条件有非常高的要求。影响高密度发酵的因素非常多，如细胞生长所需要的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、诱导方式、发酵液的ph值、补料方式及发酵液流变学特性等。

因此，对于重组大肠杆菌的发酵方法存在进一步的改进和优化需求，这也是该技术领域内的研究热点和重点之一，更是本发明得以完成的动力和出发点所在。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的问题，提供了一种高表达量、高菌体密度的重组大肠杆菌发酵方法，并且提供了一种适用于该发酵方法的发酵培养基。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌发酵培养基，由以下组分组成：

葡萄糖8～15g/l、胰化蛋白胨15～25g/l、酵母提取物10～15g/l、kh2po42～4g/l、k2hpo45～8g/l、na2hpo4·12h2o6～8g/l、(nh4)2so42～4g/l、nh4cl0.1～0.3g/l、mgso4·7h2o1.0～1.5g/l、微量元素5～10ml/l及消泡剂0.5～1ml/l，所述微量元素成分为：mnso4·5h2o0.3～0.5g/l、zncl20.5～1g/l、cocl2·6h2o1～2g/l、na2mo4·2h2o0.5～1g/l、cuso4·5h2o1～1.85g/l、feso4·7h2o5～10g/l、h3bo30.3～0.5g/l、cacl2·2h2o5～10g/l。

而且，所述的组分中，葡萄糖优选为10～13g/l、胰化蛋白胨优选为17～20g/l、酵母提取物优选为12～14g/l、kh2po4优选为2.5～3.5g/l、k2hpo4优选为6～7g/l、na2hpo4·12h2o优选为6.5～7.5g/l、(nh4)2so4优选为2.5～3g/l、nh4cl优选为0.2～0.25g/l、mgso4·7h2o优选为1.2～1.4g/l、微量元素7～9ml/l及消泡剂0.7～0.9ml/l。

而且，所述的微量元素成分中，mnso4·5h2o优选为0.35～0.45g/l、zncl2优选为0.6～0.8g/l、cocl2·6h2o优选为1。5～1.7g/l、na2mo4·2h2o优选为0.7～0.9g/l、cuso4·5h2o优选为1.5～1.7g/l、feso4·7h2o优选为7～9g/l、h3bo3优选为0.35～0.45g/l、cacl2·2h2o优选为7～9g/l。

一种牛粒细胞集落刺激因子工程菌的高密度发酵方法：按照下列步骤进行：

步骤一、将重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌经过两次活化，经检验获得二级种子液。

步骤二、发酵：将二级种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐内，调节搅拌转速和空气流速，使溶氧百分数保持不低于20％(v/v)，初始培养条件为：转速200～300r/min，通气量0.5～1.0vvm，罐压0.03～0.07mpa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至400r/min，提高通气量至1.5～2.0vvm，ph通过流加氨水控制在7.0～7.2，通过添加补料培养基进行补料培养；

采用指数-恒ph混合流加：即在发酵开始阶段，采用指数流加培养，但是在整个发酵过程中，保持恒定的ph值方法培养，即用流加葡萄糖代替酸，控制发酵过程中的ph值，维持在7.1左右，直到发酵结束，随着发酵的进行，工程菌利用葡萄糖进行生长，并产酸，发酵罐自动补入氨水中和；随着葡萄糖的利用，罐内葡萄糖浓度趋于0，此时工程菌只能利用氮源进行生长，并且产碱，罐内ph值会缓慢上升，发酵罐自动开启酸泵，补入葡萄糖；工程菌再次利用葡萄糖生长，并产酸，降低罐内的ph值；如此重复循环，工程菌在罐内不断生长，实现高密度，同时避免罐内存在过量葡萄糖发生“葡萄糖效应”而积累大量有机酸影响重组菌的生长和外源蛋白的有效表达。

步骤三、诱导：

在对数生长中后期对细胞进行诱导，每两小时取样一次，用于对发酵液的成分进行检测，持续诱导4～6小时，收获发酵液；

而且，所述的对数生长中后期为发酵罐内od600值达到50～60时。

步骤四、蛋白纯化：

对得到的发酵液进行蛋白纯化，得到目的蛋白。

优选地本发明所述的方法中，在步骤二中，所述的发酵培养基为葡萄糖8～15g/l、胰化蛋白胨15～25g/l、酵母提取物10～15g/l、kh2po42～4g/l、k2hpo45～8g/l、na2hpo4·12h2o6～8g/l、(nh4)2so42～4g/l、nh4cl0.1～0.3g/l、mgso4·7h2o1.0～1.5g/l、微量元素5～10ml/l及消泡剂0.5～1ml/l，所述微量元素成分为：mnso4·5h2o0.3～0.5g/l、zncl20.5～1g/l、cocl2·6h2o1～2g/l、na2mo4·2h2o0.5～1g/l、cuso4·5h2o1～1.85g/l、feso4·7h2o5～10g/l、h3bo30.3～0.5g/l、cacl2·2h2o5～10g/l。

优选地本发明所述的方法中，在步骤二中，所述的补料培养基为葡萄糖120～200g/l、胰化蛋白胨100～180g/l、酵母提取物60～100g/l、mgso4·7h2o10～15g/l、nacl5～8g/l。

优选地本发明所述的方法中，在步骤二中，补料的流加速度控制方法为：补料开始后的第一个小时控制流加速度为100～200ml/h，之后每2～4小时流加速度增加50～100ml/h。

优选地本发明所述的方法中，在步骤三中，所述的诱导剂为异丙基-β-d硫代半乳糖苷，浓度为0.5～1.0mm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用的菌种保存方法，大大提高了长期菌种保藏过程中的菌体稳定性，大大降低了发酵过程中由于菌种退化导致生产异常现象的出现，并且优化了发酵、补料培养基及补料方法，保证了菌体快速生长代谢所需营养条件及外部环境，大大提高了放罐时菌体含量及产物产量。

同现有技术相比较，本发明提供的发酵方法采用变指数-恒ph值混合流加补料的方法来进行重组大肠杆菌的高密度发酵。这种方式更加适合重组大肠杆菌的生长和重组酶的表达。指数流加策略根据菌体生长的需要提供充足的营养，同时恒定的比生长率避免了乙酸和其它副产物的形成。当供氧能力饱和，诱导开始以后，溶氧开始下降，发酵环境发生变化，指数流加已经无法适应这种环境，继续使用势必造成乙酸和葡萄糖的大量积累。恒ph值流加策略的使用很好地解决了这个矛盾，在这种复杂的发酵环境下，恒ph值的反馈控制显示出优越的灵敏性和适应能力，因此乙酸的积累和抑制作用都得到有效的缓解，菌体密度和酶活力都有明显的提高。

附图说明

图1为目标蛋白纯化过程中各组分的sds-page蛋白电泳图谱。

图2为目标蛋白与空载体对照的westernblot免疫印记图谱。

图3为akta离子交换层析目标蛋白的洗脱图谱。

具体实施方式

下面结合附图与具体的实施方式对本发明作进一步详细描述：

下述实施例中采用的发酵罐是镇江科润海生物工程设备有限公司生产的5l/50l发酵罐，补料瓶购自四川蜀牛公司，胰化蛋白胨、酵母提取物购自英国oxoid公司，所用消泡剂购自江苏斯德瑞克化工有限公司，其他所采用的化学试剂均购自天津市北方天医化学试剂厂。

实施例：

1.原始菌种库的建立

本实施例中所使用菌种为牛粒细胞集落刺激因子(rbg-csf)重组大肠杆菌，保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏号为cctccm2017014，保藏日期2017年1月9日，拉丁文分类命名：escherichiacolibl21bg-csf，宿主菌为大肠杆菌bl21，表达载体为pet-30a。

将构建好的重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌以1％的接种量接种于50ml液体培养基中，37℃，200r/min，培养8h，6000r/min，离心10min，然后与灭菌后的保护剂充分混匀(每100ml培养基离心出的细胞加入5保护剂)，无菌条件下分装至安瓿管中，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，冷冻干燥完毕后，将安瓿管颈部用强火焰拉细，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封，于-80℃冰箱中避光保藏。

2.菌种活化与种子液培养

取出重组牛粒细胞集落刺激因子工程菌原始菌种一支；用浸过75％酒精的脱脂棉擦净菌种管，放入超净台或者生物安全柜中；将菌种管顶端在火焰上加热，避免直接加热菌体或加热过度；将无菌水滴至加热过的菌种管顶端，使玻璃开裂；用锉刀或镊子敲下已开裂的菌种管的顶端；用无菌吸管吸取0.3mlph7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液(oxoid)，滴入菌种管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解成悬浮状液体；取约0.2ml菌悬液，转接于特定的琼脂培养基斜面或平板上，剩余的菌液注入液体培养基5ml内，进行培养。传至第三代时作为工作用菌种，分装甘油保存，每批发酵取用一支；取工作用种子划lb平板37℃恒温培养箱培养过夜，挑取单菌落接种于10mllb液体种子培养基/50ml锥形瓶中，37℃，摇床200r/min活化培养6～8h，经过镜检无杂菌，菌种形态正常，作为发酵用工作种子；一级种子液培养：以体积比2％的接种量，接入数个含100mllb培养基的500ml三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养12小时；二级种子液培养：将一级种子液以1％的体积比接种到数个含300ml种子培养基的1l三角瓶中，37℃，220r/min，摇床培养8小时，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌体形态，以确定菌种，即为发酵用种子；

3.重组大肠杆菌的发酵

采用5l发酵罐，将ph电极、溶氧电极校正并安装好；发酵培养基为葡萄糖15g/l、胰化蛋白胨25g/l、酵母提取物15g/l、kh2po44g/l、k2hpo48g/l、na2hpo4·12h2o8g/l、(nh4)2so44g/l、nh4cl0.3g/l、mgso4·7h2o1.5g/l、微量元素10ml/l及消泡剂1ml/l，所述微量元素成分为：mnso4·5h2o0.5g/l、zncl21g/l、cocl2·6h2o2g/l、na2mo4·2h2o1g/l、cuso4·5h2o1.85g/l、feso4·7h2o10g/l、h3bo30.5g/l、cacl2·2h2o10g/l。对发酵罐进行原位灭菌；灭菌后，待培养基温度降到37℃时，按接种量5％体积比接入二级种子液并进行通气搅拌培养，初始培养条件：转速300r/min，通气量1.0vvm，罐压0.07mpa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至800r/min，通气量至2vvm，控制ph在7.2；酸泵连接补料培养基，补料培养基为葡萄糖150/l、胰化蛋白胨120g/l、酵母提取物80g/l、mgso4.7h2o12g/l、nacl6g/l，流加补料培养基，流加速度为1.25ml/(l·min)，溶氧维持在50％，ph在7.2。碱泵连接氨水；根据ph调整补料，补料开始的第一个小时控制流加速度为200ml/h，之后每1小时流加速度增加50ml/h。并且当发酵罐内od600值达到60时，开始添加浓度为0.8mm的异丙基-β-d硫代半乳糖苷，每两小时取样一次，用于各种参数的检测。持续诱导4小时，发酵时间共14小时，发酵结束后菌体干重为54.45g(dcw)/l。

4.重组大肠杆菌的中试发酵

采用50l发酵罐，将ph电极、溶氧电极校正并安装好；葡萄糖15g/l、胰化蛋白胨25g/l、酵母提取物15g/l、kh2po44g/l、k2hpo48g/l、na2hpo4·12h2o8g/l、(nh4)2so44g/l、nh4cl0.3g/l、mgso4·7h2o1.5g/l、微量元素10ml/l及消泡剂1ml/l，所述微量元素成分为：mnso4·5h2o0.5g/l、zncl21g/l、cocl2·6h2o2g/l、na2mo4·2h2o1g/l、cuso4·5h2o1.85g/l、feso4·7h2o10g/l、h3bo30.5g/l、cacl2·2h2o10g/l。按照发酵罐说明书进行原位灭菌；灭菌后，待培养基温度降到37℃时，按接种量5％体积比接入二级种子液并进行通气搅拌培养，初始培养条件：转速300r/min，通气量1.0vvm，罐压0.07mpa，当溶氧低于20％后，逐步提高转速至800r/min，通气量至2vvm，控制ph在7.2；酸泵连接补料培养基，补料培养基为葡萄糖150/l、胰化蛋白胨120g/l、酵母提取物80g/l、mgso4.7h2o12g/l、nacl6g/l，流加补料培养基，流加速度为1.25ml/(l·min)，溶氧维持在50％，ph在7.2。碱泵连接氨水；根据ph调整补料，补料开始的第一个小时控制流加速度为200ml/h，之后每1小时流加速度增加50ml/h。并且当发酵罐内od600值达到70时，开始添加浓度为0.8mm的异丙基-β-d硫代半乳糖苷，每两小时取样一次，用于各种参数的检测。持续诱导4小时，发酵时间共16小时，发酵结束后菌体干重为69.3g(dcw)/l。

5.目标蛋白的纯化

将4中发酵完成的菌液中经过纯化得到目标蛋白，如图1所示，图中显示目标蛋白纯化过程中各组分的sds-page蛋白电泳图谱，其中1为marker，2为包涵体溶解后的蛋白，3为复性浓缩后的蛋白，4和5为akata纯化的蛋白，图中显示目标蛋白的大小21kd与蛋白的序列长度相符，图中证实在纯化的过程中，各组分内均含有目标蛋白。

如图2所示，图中显示目标蛋白与空载体对照的的westernblot免疫印记图谱，其中1为目标蛋白bg-csf，2为空载体对照；3为marker，图中确认了目标蛋白的大小为21.5kd。

如图3所示，图3为akta离子交换层析目标蛋白的洗脱图谱，其中a为目标蛋白的洗脱峰，在10.0ml-15.0ml的区间目标蛋白完成了洗脱，目标蛋白的洗脱峰达到90.0左右的mau。

以上对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。