一种治疗肝癌的益生菌发酵中药复方组合物及其制备和检测方法与流程

本发明涉及一种中药提取物经肠道益生菌发酵制得的发酵组合物，以及该发酵组合物在制备用于治疗肝癌的药品中的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术：

肝细胞癌(HCC)是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三位，仅次于胃癌和食管癌，其发病率有上升趋势，严重危害人类健康与生存。随着现代生物医学技术、临床外科技术、微创治疗技术等的发展，肝癌的临床诊治工作水平呈现稳步而持续的提高。近二十年来，随着医学物理学、影像学、麻醉学、免疫学、分子生物学的不断发展以及外科技术的日臻成熟，我国原发性肝癌的治疗取得了长足的进步，手术切除率、术后生存率及术后生活质量均有较大提高。但与其他肿瘤治疗相比，肝癌的疗效远未如人意，究其原因除肝癌本身的生物学特性决定了其预后外，治疗方法的选择、病人甚至医生的治疗观念亦是影响疗效的重要因素。

中医中药治疗肝癌，采取辨证施治、攻补兼施的方法，常与其他疗法配合应用，以提高机体抗病力，改善全身状况和症状，减轻化疗、放疗不良反应。应该说，很多肝癌患者及其家属对中药情有独钟，因为他们知道西药“治标不治本”，而且毒副作用极大，所以他们不想用西药治疗自己的病，想用“扶正祛邪、标本兼治”的中药来调理和治疗。可是，传统中药汤剂也有不足，那就是气味儿难闻，长期服用的话很多患者难以耐受，甚至闻到药味儿就想吐。虽说“良药苦口利于病”，但长此以往影响了患者胃口，反而不利于患者体质的改善、病情的恢复。

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。

化疗药物及射线会杀死益生菌，导致肠内菌群失调。表现为腹胀、便秘、营养物质丢失及毒素被吸收，不但影响患者康复，还有可能迫使化疗、放疗中断，影响患者的食欲，进一步降低患者的免疫力，形成恶性循环。

技术实现要素：

为了克服现有技术治疗肝癌的不足，本发明的一个目的是提供一种治疗肝癌的益生菌发酵中药复方组合物，该组合物由中药复方提取物经肠道益生菌发酵后制得。采用的技术方案为：中药复方药材经水提后加入不同配比的营养物和无机盐等，高温灭菌，接入复合肠道益生菌发酵后稳定化处理即得益生菌发酵中药复方组合物。

本发明所述的中药复方由如下原料药组成（按重量份计）：

柴胡12-40重量份、黄芩12-40重量份、红参4-24重量份、 田基黄48-96重量份、垂盆草48-96重量份、炙鳖甲36-80重量份、丹参36-48重量份、夏枯草24-60重量份、生牡蛎36-80重量份、延胡索12-40重量份、片姜黄12-36重量份、猪苓24-40重量份、炙甘草8-36重量份。

根据本发明的一个优选实施方案，本发明所述中药复方由如下原料药组成（按重量份计）：

柴胡20重量份、黄芩20重量份、红参8重量份、田基黄48重量份、垂盆草48重量份、炙鳖甲36重量份、丹参36重量份、夏枯草24重量份、生牡蛎40重量份、延胡索24重量份、片姜黄24重量份、猪苓24重量份、炙甘草8重量份

本发明的另一个目的是提供一种制备上述益生菌发酵中药复方组合物的制备方法，其步骤如下：

(a)上述十三味中药，取炙鳖甲粉碎,细度在20目～40目；与其它十二味中药加水煎煮两次，第一次加12倍量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，第二次加10倍量水煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.01～1.05（60℃），得中药复方提取液；所得中药复方提取液经过冷沉后可得到上清液；

(b)向步骤（a）得到的中药复方提取液或其冷沉后得到的上清液中加入一定量的葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、酵母粉和无机盐，添加或不添加甜味剂，定容，调节pH值至6.5～7.0，于115℃高温高压灭菌50min，得无菌中药复方提取物。

(c)当上述无菌中药复方提取物温度降至39℃时，接种预培养的各体积百分比为0.5%的一种或两种及以上双歧杆菌菌液，常规培养约3～6小时后，再次接种预培养的各体积百分比为0.5%的一种或两种及以上乳杆菌菌液，继续发酵22～27小时，当pH值降至4.1以下时，结束发酵，稳定化处理，即得所述的益生菌发酵中药复方组合物。

根据本发明，中药复方提取物发酵中所使用的益生菌选自双歧杆菌和乳杆菌。

根据本发明的一个优选实施方案，所述的用于发酵中药复方提取液的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌；其中所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌(菌种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉) 或中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)(中国，北京)或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株)。

所述葡萄糖的加入量为0.7g/100ml，酵母膏的加入量为0.13g/100ml，酵母粉的加入量为0.07g/100ml，蛋白胨的加入量为0.4g/100ml。

为改善口感，上述制备方法中，步骤（b）中所述甜味剂种类及用量为蔗糖3.0g/100ml、三氯蔗糖0.008g/100ml。

本发明的再一个目的是提供该发酵组合物的鉴别和检测方法：

【鉴别】

（1）取本发明的益生菌发酵中药复方组合物5ml，用盐酸调pH至1-2，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次5ml，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至2ml，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取供试品溶液2ul、对照品溶液1ul分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5：3：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗色斑点。

（2）取[鉴别]（1）项下供试品溶液，作为供试品溶液。另取原儿茶醛对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取供试品溶液10ul、对照品溶液2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（12：2：1：0.8）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同蓝灰颜色的斑点。

（3）取本发明的益生菌发酵中药复方组合物20ml，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，水浴蒸干正丁醇液，残渣用甲醇定容至2ml，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材细粉0.5g，加甲醇30ml，超声提取30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水20ml使溶解，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取供试品溶液10ul、柴胡对照药材溶液5ul分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13：7：2）的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

（4）取本发明的益生菌发酵中药复方组合物20ml，用浓氨试液调pH至9-10，加乙醚振摇提取2次，每次15ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至1ml，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取供试品溶液5ul、对照品溶液2ul，分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（10：6：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘缸中熏蒸约5分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄绿颜色的荧光斑点。

【检测方法】

（1）对照品溶液的制备 称取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml约含0.2mg的溶液，即得。

（2）标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂作空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2015年版四部0401)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（3）测定法 精密量取本发明的益生菌发酵中药复方组合物5ml，缓缓加入无水乙醇7.5ml，边加边振摇，再加60%乙醇12ml，摇匀，密封，离心，上清液转移至25ml容量瓶中，加少量60%乙醇清洗沉淀并定容至刻度。精密量取10ml加水定容至100ml，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液5ml，置25ml容量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法操作，另精密吸取供试品溶液5ml，加水稀释至25ml，摇匀，作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算，即得。

本品每1ml含总黄酮按芦丁（C27H30O16）计，不得少于2.8mg。

本发明的有益效果：

本发明模拟肠道生物环境，接入肠道复合活性益生菌，发酵中药复方提取物，可以显著提高中药复方提取物的口感，减轻中药提取物对肠胃的刺激性，可以改善患者的胃口，提高患者的体质。

本发明中，中药复方提取物经益生菌发酵后可以显著提高中药提取物的疗效，提高抑瘤率。为检测本发明的治疗肝癌的益生菌发酵中药复方组合物的抗肿瘤效果，本发明实验例采用大鼠移植性肝癌模型展开抗肿瘤活性的研究，结果分析显示本发明的治疗肝癌的益生菌发酵中药复方组合物能改善大鼠的生命体征，减轻腹水程度。发酵组合物组瘤灶内坏死情况重于未发酵组，从而导致肿瘤质量减轻，发酵组肿瘤抑制率高，尤其是中、高剂量组较明显，与同浓度未发酵组比较有显著性差异（P<0.05），说明经益生菌发酵后能显著提高本复方制剂的抗肝癌作用，尤其在抑制肝脏肿瘤增长方面有显著性作用。

附图说明

图1为本发明的益生菌发酵中药复方组合物中黄芩的薄层色谱图；图中：1、2、3分别为黄芩供试品溶液a1、b1、c1，4、5为黄芩苷对照品，6、7为缺黄芩阴性样品。

图2为本发明的益生菌发酵中药复方组合物中丹参的薄层色谱图；图中：1、2、3分别为丹参供试品溶液a2、b2、c2，4为原儿茶醛对照品，5为缺丹参阴性样品。

图3为本发明的益生菌发酵中药复方组合物中柴胡的薄层色谱图；图中：1为缺柴胡阴性样品，2、3、4分别为柴胡供试品溶液a3、b3、c3，5为柴胡对照药材。

图4为本发明的益生菌发酵中药复方组合物中延胡索的薄层色谱图；图中：1、2、3分别为延胡索供试品溶液a4、b4、c4，4、5为延胡索乙素对照品，6、7为缺延胡索阴性样品。

具体实施方式

实施例1：益生菌发酵中药复方组合物A的制备

按下列重量称取各中药成分：柴胡20g，黄芩20g，红参8g，田基黄48g，垂盆草48g，炙鳖甲36g，丹参36g，夏枯草24g，生牡蛎40g，延胡索24g，片姜黄24g，猪苓24g，炙甘草8g。取炙鳖甲粉碎,过20目筛；与其它十二味中药加水煎煮两次，第一次加12倍量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，第二次加10倍量水煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.01～1.05（60℃），得中药复方提取液；向上述中药复方提取液中加入葡萄糖0.7g/100ml、蛋白胨0.4g/100ml、酵母膏0.13g/100ml、酵母粉0.07g/100ml、无机盐（K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、硫酸亚铁•7H2O 5.0mg/100ml、硫酸锌•7H2O 4.4mg/100ml、硫酸镁•7H2O 50mg/100ml）、蔗糖3.0g/100ml和三氯蔗糖0.008g/100ml，定容至1000ml,调节pH值至6.5，于115℃高温高压灭菌50min，得无菌中药复方提取物。当上述无菌中药复方提取物温度降至39℃时，接种预培养的体积百分比为0.5%的短双歧杆菌（AS 1.2213）菌液，常规培养5小时后，再次接种预培养的各体积百分比为0.5%的德氏乳杆菌(AS 1.1480)和嗜酸乳杆菌(AS 1.1854)菌液，继续37℃发酵24小时，当pH值降至4.1以下时，结束发酵，于无菌条件下灌装后稳定化处理，即得益生菌发酵中药复方组合物A。此发酵组合物中总黄酮含量为:4.34mg/ml。

实施例2：益生菌发酵中药复方组合物B的制备

按下列重量称取各中药成分: 柴胡20g，黄芩20g，红参8g，田基黄48g，垂盆草48g，炙鳖甲36g，丹参36g，夏枯草24g，生牡蛎40g，延胡索24g，片姜黄24g，猪苓24g，炙甘草8g。取炙鳖甲粉碎,过30目筛；与其它十二味中药加水煎煮两次，第一次加12倍量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，第二次加10倍量水煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.01～1.05（60℃），得中药复方提取液。向上述中药复方提取液中加入葡萄糖0.7g/100ml、蛋白胨0.4g/100ml、酵母膏0.13g/100ml、酵母粉0.07g/100ml、无机盐（K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、硫酸亚铁•7H2O 5.0mg/100ml、硫酸锌•7H2O 4.4mg/100ml、硫酸镁•7H2O 50mg/100ml），定容至1000ml,调节pH值至7.0，于115℃高温高压灭菌50min，得无菌中药复方提取物。当上述无菌中药复方提取物温度降至39℃时，接种预培养的各体积百分比为0.5%的青春双歧杆菌(AS 1.2190)和婴儿双歧杆菌(AS 1.853)菌液，常规培养3小时后，再次接种预培养的各体积百分比为0.5%的鼠李糖乳杆菌(AS 1.22)菌液，继续37℃发酵26小时，当pH值降至4.1以下时，结束发酵，于无菌条件下灌装后稳定化处理，即得益生菌发酵中药复方组合物B。此发酵组合物中总黄酮含量为:4.63mg/ml。

实施例3：益生菌发酵中药复方组合物C的制备

按下列重量称取各中药成分:柴胡20g，黄芩20g，红参8g，田基黄48g，垂盆草48g，炙鳖甲36g，丹参36g，夏枯草24g，生牡蛎40g，延胡索24g，片姜黄24g，猪苓24g，炙甘草8g。取炙鳖甲粉碎,过40目筛；与其它十二味中药加水煎煮两次，第一次加12倍量水浸泡1.0小时，煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，第二次加10倍量水煎煮，煮沸后保持微沸1.0小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.01～1.05（60℃），得中药复方提取液，将上述中药复方提取液冷沉5小时后取上清液，加入葡萄糖0.7g/100ml、蛋白胨0.4g/100ml、酵母膏0.13g/100ml、酵母粉0.07g/100ml、无机盐（K2HPO4•3H2O 0.1g/100ml、KH2PO4 0.1g/100ml、硫酸亚铁•7H2O 5.0mg/100ml、硫酸锌•7H2O 4.4mg/100ml、硫酸镁•7H2O 50mg/100ml），定容至1000ml,调节pH值至6.5，于115℃高温高压灭菌50min，得无菌中药复方提取物。当上述无菌中药复方提取物温度降至39℃时，接种预培养的体积百分比为0.5%的两歧双歧杆菌（正常人体分离，经中国科学院微生物研究所鉴定）菌液，常规培养6小时后，再次接种预培养的各体积百分比为0.5%的德氏乳杆菌(AS 1.1480)和植物乳杆菌（AS 1.19）菌液，继续37℃发酵23小时，当pH值降至4.1以下时，结束发酵，于无菌条件下灌装后稳定化处理，即得益生菌发酵中药复方组合物C。此发酵组合物中总黄酮含量为:5.18mg/ml。

实验例1：本发明益生菌发酵中药复方组合物与未发酵组合物的抗肿瘤活性比较

本实验例采用大鼠移植性肝癌模型展开抗肿瘤活性的研究，该模型实验周期短，造模稳定，最重要的是肝癌原位肝移植在肝内增殖的生物学行为与人类原发性肝癌相似。

一、材料与方法：

1、动物：Walker256荷瘤幼鼠（3-4周龄），体重（70±10）g，4只。雄性SD幼鼠（70±10）g，5只，SPF级健康雄性SD大鼠（190±10）g，购自山东中医药大学实验动物中心。

2、受试样品：受试样品为上述实施例中制备的益生菌发酵中药复方组合物A、B、C及其对应的未发酵中药复方组合物。受试样品人体推荐量为250ml/（人·日），按60kg人体体重计，即4.17ml/（kg·日），大鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍，按此人体推荐剂量的5倍、10倍、20倍分别设为低剂量组、中剂量组和高剂量组。低剂量组：2.08ml/（100g·日）、中剂量组：4.17ml/（100g·日）、高剂量组：8.34ml/（100g·日）。

3、分组及造模：

3.1分组：将健康雄性SD大鼠平均分成3组。其中正常组、假手术组各20只，其余大鼠做移植肝癌手术，术后将存活大鼠再随机分组：分别为模型组、益生菌发酵中药复方组合物A、B、C及其对应的未发酵中药复方组合物的低、中、高剂量组，各20只。

3.2造模：将肿瘤鼠腹部消毒，抽取含肿瘤细胞的腹腔液，调整细胞浓度为（4-6）×10⁹cells/L备用，将前述含肿瘤细胞腹腔液注射到腋窝皮下，每个注射点0.3ml，7d后皮下瘤直径约1cm左右；皮下移植瘤模型制备成功后，将其麻醉，浸泡入75％乙醇中全身消毒，在超净工作台内切取皮下瘤块，挑选周边生长旺盛的鱼肉样组织，切成1mm×1mm大小的瘤块，置于RPMI-1640培养液中4℃保存备用，所有瘤块均须在2h内移植完。将成年SD大鼠麻醉，上腹正中常规备皮，开腹暴露肝左叶和肝右叶，在其膈面用眼科镊剪刺破肝包膜，在包膜下作0.5cm长的隧道，将备好的瘤组织块植入，确认瘤组织未退出、无出血后逐层缝合腹壁。假手术组打开隧道，但不植入瘤块。

4.用药：完成造模手术后3d开始灌胃，正常组、假手术组、模型组给予1ml/(100g·日)纯水灌胃；给药组按实验剂量分别给予1ml/(100g·日)的给药剂量灌胃。

5.观察指标及检测方法

分别于用药后1周（1w），2周(2w)，3周(3w)各组分别随即抽取6只大鼠取材。观察大鼠进食、饮水、活动、背毛、体质量、精神状态。记录肝脏内肿瘤组织的质量，并计算肿瘤质量抑制率（%）=（1-给药组肿瘤质量/模型组肿瘤质量）×100%。

二、结果：

1、一般状况观察

造模后大鼠精神状态短期内快速转差，毛色枯萎，活动量明显减少，进食量和饮水减少。喂食受试物组大鼠精神状态普遍转好，偶见大鼠间嬉闹，进食量多。

2、受试样品对移植性肝癌大鼠肿瘤质量抑制率影响

表1 各组的肿瘤质量抑制率比较

注：表格中组别A、B、C后的数字1、2、3分别对应各组未发酵组合物的低、中、高剂量组，4、5、6分别对应各组发酵组合物的低、中、高剂量组

*与模型组比较有显著性差异，P<0.05

▲发酵组与同浓度的未发酵组比较有显著性差异，P<0.05

三、结果分析：

肿瘤质量抑制率：1周时发酵组合物A的中、高剂量组，发酵组合物B的中剂量组与对应未发酵组合物同浓度的比较有显著差异性；2周时发酵组合物B的高剂量组，发酵组合物C的高剂量组与对应未发酵组合物同浓度的比较有显著差异性；3周时发酵组合物C的中、高剂量组与对应未发酵组合物同浓度的比较有显著差异性。

本实验例结果分析显示，本发明的治疗肝癌的益生菌发酵中药复方组合物能改善大鼠的生命体征，减轻腹水程度。发酵组合物组瘤灶内坏死情况重于未发酵组，从而导致肿瘤质量减轻，发酵组肿瘤抑制率高，尤其是中、高剂量组较明显，与同浓度未发酵组比较有显著性差异（P<0.05），说明经益生菌发酵后能显著提高本复方制剂的抗肝癌作用，尤其在抑制肝脏肿瘤增长方面有显著性作用。

实验例2：对益生菌发酵中药复方组合物A、B、C进行实验测定

1、鉴别

1.1仪器与试液

仪器：ZF-2型三用紫外仪、电热恒温鼓风干燥箱、METTLER AB204型电子分析天平、碘缸、点样器等。

试液：乙酸乙酯、正丁醇、乙醚、盐酸、三氯化铁、对二甲氨基苯甲醛、浓氨试液、碘、黄芩苷对照品（715-9405，供鉴别用）、原儿茶醛（0810-9402，供鉴别用）、延胡素乙素（726-8903，供鉴别用）、柴胡对照药材（120992-201108）等。

1.2黄芩鉴别

1.2.1样品液制备

（1）供试品溶液的制备：取实施例中的益生菌发酵组合物A、B、C各5ml，用盐酸调pH至1-2，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次5ml，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至2ml，作为供试品溶液a1、b1、c1。

（2）缺黄芩阴性对照样品溶液的制备：取益生菌发酵组合物A对应的缺黄芩阴性样品5ml，同上法制备缺黄芩阴性样品液。

（3）黄芩苷对照品溶液的制备：取黄芩苷（715-9405，供鉴别用）3.0mg，加甲醇2ml溶解，作为对照品溶液。

1.2.2薄层鉴别

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取各供试品溶液、缺黄芩阴性对照样品溶液各2ul、对照品溶液1ul，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5：3：1：1）为展开剂，展开（展距为：7cm，温度：16℃ 湿度：50%），取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。

结果分析：黄芩苷Rf=3.6/7，见附图1，从图中可以看出该展开剂能很好的分离各成分，斑点分离较好，Rf值适中，专属性强，阴性无干扰，该方法可以作为本发明组合物中黄芩的鉴别方法。

实验过程中，还用36%醋酸为展开剂，分离效果略差，故没有采用。

1.3、丹参鉴别

1.3.1样品液制备

（1）供试品溶液的制备：取黄芩项下供试样品溶液作为本供试品溶液a2、b2、c2。

（2）缺丹参阴性对照样品溶液的制备：取益生菌发酵组合物A对应的缺丹参阴性样品5ml，同上法制备缺丹参阴性样品液。

（3）原儿茶醛对照品溶液：取原儿茶醛对照品（0810-9402）2mg，加甲醇使溶解定容至2ml。

1.3.2薄层鉴别

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取各供试品溶液、缺丹参阴性对照样品溶液各10ul、对照品溶液2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（12：2：1：0.8）为展开剂，展开（展距：9 cm，温度：21℃ 湿度：53%），取出，晾干，喷以3%三氯化铁乙醇溶液显色至斑点清晰。

结果分析：分离效果较好，阴性无干扰。见附图2，从图中可以看出特征斑点清晰分明，Rf值适中，专属性强，阴性无干扰，该方法可以作为本发明组合物中丹参的鉴别方法。

曾实验以三氯甲烷-丙酮-甲酸（10：1：1）为展开剂，展开效果较差，因此没有采用。

另外，还实验了以聚酰胺薄膜为载体，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10：3：1：2）为展开剂，结果：阴性略有干扰，因此未采用。

1.4、柴胡鉴别

1.4.1样品液制备

（1）供试品溶液的制备：取实施例中的益生菌发酵组合物A、B、C各20ml，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，水浴蒸干正丁醇液，残渣用甲醇定容至2ml，作为供试品溶液a3、b3、c3。

（2）缺柴胡阴性对照样品溶液的制备：取益生菌发酵组合物A对应的缺柴胡阴性样品20ml，同上法制备缺柴胡阴性样品液。

（3）柴胡对照药材溶液的制备：称取柴胡对照药材（120992-201108）0.5g，加甲醇30ml，超声提取30min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水20ml使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次10ml，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次10ml，水浴蒸干正丁醇液，残渣用甲醇定容至2ml，作为对照药材溶液。

1.4.2薄层鉴别

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取供试品溶液、缺柴胡阴性对照样品溶液各10ul，柴胡对照药材溶液5ul分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13：7：2）的下层溶液为展开剂，展开（展距为：9cm，温度：15℃ 湿度：50%），取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加热至斑点显色清晰。

结果分析：分离效果较好，阴性无干扰，见附图3，从图中可以看出该展开剂能很好的分离各斑点，Rf值适中，专属性强，阴性无干扰，该方法可以作为本发明组合物中柴胡的鉴别方法。

曾试验中国药典2015版一部中柴胡药材项下展开剂：乙酸乙酯-乙醇-水（8：2：1），展开效果不佳，阴性有干扰，因此未采用。

1.5、延胡索鉴别

1.5.1样品液制备

（1）供试品溶液的制备：取实施例中的益生菌发酵组合物A、B、C各20ml，用浓氨试液调pH至9-10，加乙醚振摇提取2次，每次15ml，合并乙醚液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至1ml，作为供试品溶液a4、b4、c4。

（2）缺延胡索阴性对照样品溶液的制备：取益生菌发酵组合物A对应的缺延胡索阴性样品20ml，同上法制备缺延胡索阴性样品液。

（3）对照品：取延胡索乙素（726-8903，供鉴别用）2.0mg，加甲醇5ml溶解，作为对照品溶液。

1.5.2薄层鉴别

照薄层色谱法（中国药典2015年版四部0502）试验，吸取各供试品溶液、缺延胡索阴性对照样品溶液各5ul、对照品溶液2ul，分别点于同一用0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇（10：6：1）为展开剂，展开（展距：8.5cm，温度：14℃ 湿度：62%），取出，晾干，置碘缸中熏蒸约5分钟后取出，挥尽板上吸附的碘后，置紫外灯（365nm）下检视。

结果分析：分离效果较好，阴性无干扰，见附图4，从图中可以看出使用该展开剂展开并用碘熏后，各斑点分离效果较好，并且斑点显色清晰，阴性无干扰，专属性强，该方法可以作为本发明组合物中延胡索的鉴别方法。

曾试验使用不含氢氧化钠的硅胶G薄层板展开，展开效果不佳，并且斑点显色不清晰，故未采用。

2、含量检测实验

2.1仪器与试药

仪器：分析天平（METTLER TOLEDO AB204）、L5紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

试药：芦丁对照品（080-9303，中国药品生物制品检定所），乙醇，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠均为分析纯。

2.2线性关系的考察

准确称取102mg芦丁对照品置50ml容量瓶中，加入60％乙醇35ml，超声处理使完全溶解，放冷，加60％乙醇至刻度，摇匀。即得质量浓度为2.04mg/ml的对照品溶液。精密量取5ml，置50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.204mg/ml的对照品稀释溶液。

精密量取对照品稀释溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml，分别置25ml容量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂作空白，照紫外-可见分光光度法，在500nm波长处测定吸光度。结果见表2

表2 线性关系考察结果

回归方程y=0.0113x+0.0092，相关系数r=0.9998。

试验结果表明，芦丁对照品在8.16～48.96μg/ml之间与吸收度呈良好的线性关系。

2.3供试品溶液制备方法的考察

方法学考察使用的样品是实施例1中制备的益生菌发酵中药复方组合物A

取益生菌发酵中药复方组合物A5ml，加无水乙醇7.5ml，边加边振摇，加60%乙醇12ml，摇匀，密封，离心，上清液转移至25ml容量瓶中，加少量60%乙醇清洗沉淀并定容至刻度。精密量取10ml加水定容至100ml，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取供试品溶液2ml、5ml，分别置25ml容量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，另精密吸取供试品稀释溶液2ml、5ml，分别置25ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，作空白，依法测定吸光度。见表3

表3 取样量考察结果

结果表明：两者均在线性范围内，但考虑到取样准确和各批次间存在差异，因此，取供试样品溶液5ml测定吸收度合理。

2.4仪器精密度实验

取2.2项下的芦丁对照品稀释溶液3ml样品连续测定6次，测其吸收度。结果见表4。

表4 仪器精密度试验结果

结果表明：仪器精密度良好。（RSD<2.0%）

2.5样品稳定性实验

取2.3项下制备的供试品溶液5ml样品，每隔3分钟测定一次吸收度，共考察18分钟，计算RSD，以观察供试品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。结果见表5。

表5 稳定性试验结果

结果表明：供试品溶液在18分钟内稳定性良好，能够满足测定需要。(RSD<2.0%)

2.6重复性考察实验

取样品益生菌发酵中药复方组合物B，按照供试品溶液的制备方法，平行制备6份样品，按上述方法和条件进行测定，计算每份供试品的含量。结果见表6。

表6 重复性考察结果

从测定结果看出，本品含量测定方法的重复性良好。(RSD<2.0%)

2.7加样回收率实验

精密吸取已测知含量的样品益生菌发酵中药复方组合物B（总黄酮含量为6.68mg/ml）3ml，共6份，分别加入无水乙醇4.5ml，边加边振摇，每一份中精密加入芦丁对照品溶液10ml（质量浓度为2.04mg/ml），摇匀，离心，上清液分别置25ml容量瓶中，加60%乙醇洗涤沉淀并定容至刻度，摇匀，分别精密量取5ml置100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按上述测定方法进行测定，计算回收率。结果见表7。

表7 芦丁加样回收率试验结果

试验结果表明，总黄酮以芦丁作对照品用该测定方法回收率良好。（RSD<2.0%）

2.8样品测定

（1）对照品溶液的制备：称取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml约含0.2mg的溶液，即得。

（2）标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂作空白，照紫外-可见分光光度法（附录 A)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（3）测定法 精密量取实施例中的益生菌发酵中药复方组合物A、B、C各5ml，缓缓加入无水乙醇7.5ml，边加边振摇，再加60%乙醇12ml，摇匀，密封，离心，上清液转移至25ml容量瓶中，加少量60%乙醇清洗沉淀并定容至刻度。精密量取10ml加水定容至100ml，摇匀，即得各供试品溶液。精密吸取各供试品溶液5ml，置25ml容量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法操作，另精密吸取各供试品溶液5ml，加水稀释至25ml，摇匀，作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中芦丁的量，计算，即得。

经检测，益生菌发酵中药复方组合物A中的总黄酮含量为:4.34mg/ml，发酵组合物B中总黄酮含量为:4.63mg/ml，发酵组合物C中总黄酮含量为:5.18mg/ml。