抗人芳香烃受体单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明属于生物、环境检测领域，具体涉及抗人芳香烃受体单克隆抗体，产生所述单克隆抗体的杂交瘤，包含所述单克隆抗体的组合物，以及所述单克隆抗体的使用方法和用途。

背景技术：

人芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一种配基依赖性的转录因子。AhR属于螺旋-环-螺旋超家族中新发现的一个亚家族-PAS中的bHLH-PAS亚家族成员，具有一个碱性的螺旋-环-螺旋-PAS结构域。根据各部分功能的不同，AhR从N末端到C末端大致可划分为3个功能域：bHLH域、PAS域和转录激活域(TAD)。位于AhR分子N末端的bHLH结构域对蛋白质分子二聚化及DNA结合是必需的，其中b区决定结合DNA序列的特异性,HLH区似乎是蛋白质二聚化的接触界面。PAS域是在bHLH的羧基端由约250-300个氨基酸组成的同源序列，它包括2个由50个左右氨基酸组成的疏水共有序列，分别称为PAS(A)和PAS(B)。PAS(A)具有调节bHLH区域的构象,限制其广泛的二聚化的作用。该家族中最保守的PAS(B)区位于AhR第232-402位氨基酸，该区域具有配体结合的功能，该区域的自发突变可降低AhR与配体的亲和力。TAD定位于分子的羧基末端。不同于bHLH和PAS区的氨基酸序列在物种之间高度保守,该区域氨基酸的同源性较差，通常称为可变区。它包括富含酸性氨基酸区，富含谷氨酸区和富含P/S/T区，各区域之间既可独立激活转录又存在着协同作用。该区域介导增强子与启动子之间的信号传导，使之产生一种有利于启动子占位的染色质构象。另外，AhR还包含一个顺式作用抑制区，该区参与HSP90的结合，在有些细胞中可能参与抑制AhR的转录激活功能。

静息状态下的AhR在细胞质中与2分子Hsp90、1分子p23辅助伴侣蛋白分子和1分子XAP2(也可能是AIP或ARA9)形成四聚体复合物。当配基与细胞质中AhR结合后，AhR被激活进而构象发生变化，暴露出入核序列，在入核序列的引导下进入细胞核，入核的AhR与芳香烃受体核转位蛋白及其它转录因子结合形成复合物，这些复合物可以结合到特定的DNA序列---DRE上，进而调控细胞色素P450等基因的表达，从而产生多种健康效应和毒理学效应，例如肝毒性，皮肤毒性，神经毒性，免疫毒性，致畸性，消耗综合症，内分泌干扰，诱导肿瘤的发生等。AhR的配基包括内源性配基和外源性配基，它们的结构存在较大差异，产生的作用也存在较大差异。

AhR除了能介导产生多种生物学和毒理学效应外，近年研究发现AhR还具有重要的生理学功能，例如AhR能够维持免疫平衡，是膳食化合物与肠道免疫系统的感受器，此外它还能够影响肠道微生物种群，甚至能够提高肿瘤的逃逸。

抗体作为重要的免疫学工具，在研究AhR介导的多种生物学和毒理学效应的分子机制以及发挥的生理学功能等方面具有广泛而重要的作用，例如研究配体对AhR的活化，AhR在细胞质和细胞核内与其它蛋白之间的相互作用，以及AhR与其它转录因子形成的复合物与DNA之间的相互作用。此外，近年来利用抗AhR抗体，并根据AhR信号通路中活化的AhR复合物与特异的DNA序列结合的特性所研究开发的Ah-Immunity检测方法，可以用来检测环境中能激活AhR的芳香烃类化合物，例如二恶英类化合物，多环芳香烃类化合物，卤代芳香烃类化合物等。

目前商品化抗人源的AhR抗体有多克隆抗体和单克隆抗体。(1)多克隆抗体：与单克隆抗体相比，目前商品化的多克隆抗体种类较多，有兔多抗，山羊多抗，小鼠多抗和绵羊多抗等。在制备技术上，多克隆抗体具有成本低廉，所需技术和技能不高以及所需时间短等优点，但是易于产生批次间差异，产生大量非特异性抗体。在应用上，多克隆抗体因为能识别任一抗原上的多个表位，所以有助于放大低表达水平的靶蛋白信号；可在IP/ChIP中得到更好的结果；更能容许抗原中的微小变化。但是同时又因为靶蛋白可在多个表位上结合不止一个抗体分子，会给定量实验造成不利影响，导致结果不准确；也会识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质；不适用于探测抗原的特定结构域等。(2)单克隆抗体：目前商品化的AhR单克隆抗体识别AhR的位点有四个，分别能识别AhR氨基酸序列的12-17&22-31，279-376，637-848和721-821位氨基酸。单克隆抗体由于是单克隆杂交瘤细胞株制得，所有批次都相同，对确保实验步骤和结果的一致性和标准化非常有帮助。与多克隆抗体相比，单克隆抗体的同质性非常高。如果实验条件保持不变，单克隆抗体的各实验结果重现性很高。另外，单克隆抗体只能检测某一抗原上的一个表位。所以可以更特异性地检测一个靶表位，而不与其它蛋白质发生交叉反应，进而所产生的背景显著低于多克隆抗体。单克隆抗体的特异性能使其在混合物中与抗原高效地结合，但是单抗使用时经过抗原的化学处理后比多克隆抗体更易于丢失表位，这可通过使用同一抗原的两个或多个单克隆抗体进行补偿。

基于此，为了满足广泛深入开展AhR介导的多种效应的复杂分子机制的研究以及环境中芳香烃受体类化合物的检测，本领域仍需要更多能够识别AhR不同结构域、不同位点的单克隆抗体。

技术实现要素：

本发明的发明人经过大量实验，成功筛选获得了分泌抗人芳香烃受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对分泌的单克隆抗体在免疫学方法的应用上进行了研究，由此完成了本发明。

因此，本发明第一方面提供了特异性结合人芳香烃受体(hAhR)的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体与保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、具有保藏号CGMCC No.10318的杂交瘤产生的抗体具有相同的重链CDR区和轻链CDR区。

在本发明的一个实施方案中，所述单克隆抗体与保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、具有保藏号CGMCC No.10318的杂交瘤产生的抗体具有相同的重链可变区和轻链可变区。

根据已知单克隆抗体测定其轻链和重链的氨基酸序列已为本领域的公知常识，因此本领域技术人员完全可以根据保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、具有保藏号CGMCC No.10318的杂交瘤产生的抗体测得其轻链和重链的氨基酸序列，包括其CDR区和可变区的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，所述单克隆抗体FlAhR-Ma4a6的亚型为IgG2a。

在本发明的一个实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合部分识别人芳香烃受体上的具有序列VCYNPDQIPPENSPL(SEQ ID NO：1)的肽段或表位。

在本发明的一个实施方案中，所述单克隆抗体为由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、具有保藏号CGMCC No.10318的杂交瘤产生的抗体，即抗体FlAhR-Ma4a6。

在另一个方面，本发明提供了特异性结合人芳香烃受体的抗体或其抗原结合部分，其与单克隆抗体FlAhR-Ma4a6竞争结合人芳香烃受体上的肽段或表位，所述单克隆抗体FlAhR-Ma4a6为由保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、具有保藏号CGMCC No.10318的杂交瘤产生的抗体。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的肽段或表位的序列包含VCYNPDQIPPENSPL(SEQ ID NO:1)。在本发明的一个具体实施方案中，其中所述的肽段或表位的序列为VCYNPDQIPPENSPL(SEQ ID NO：1)。

在另一个方面，本发明提供了一种杂交瘤，其以保藏号CGMCC No.10318保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

在另一个方面，本发明提供了一种多肽或表位，其序列为VCYNPDQIPPENSPL(SEQ ID NO：1)。

在本发明的实施方案中，所述多肽可以和本发明第一方面任一项的单克隆抗体或其抗原结合部分特异性结合。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分。

在另一个方面，本发明提供了检测人芳香烃受体在样品中的存在或其表达水平的方法，其包括使用本发明第一方面任一项的抗体或其抗原结合部分。

在一个优选的实施方案中，所述样品是组织样品，例如肿瘤组织样品，例如肝、肾、脑等组织样品。在一个优选的实施方案中，所述样品是细胞样品，例如人肝癌细胞、大鼠肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人肾小管上皮细胞、人胚肾上皮细胞、人宫颈癌细胞等细胞样品，例如细胞的裂解液。在一个优选的实施方案中，所述的细胞为未经过裂解处理的细胞，例如为人芳香烃受体原位表达的细胞。在一个实施方案中，所述细胞为宫颈癌细胞，例如为HeLa细胞。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合部分。此类第二抗体是本领域公知的，例如但不限于可识别抗体FlAhR-Ma4a6的抗小鼠IgG抗体。在一个优选的实施方案中，所述方法包括但不限于，Western印迹法、ELISA法、免疫沉淀法、免疫荧光法和免疫组织化学法。在一个优选的实施方案中，所述方法不是疾病的诊断方法。

在另一个方面，还提供了本发明的抗体或其抗原结合部分的用途，其用于检测人芳香烃受体在样品中的存在或其表达水平，或者用于制备试剂盒，所述试剂盒用于检测人芳香烃受体在样品中的存在或其表达水平。

在一个优选的实施方案中，所述样品是组织样品，例如肿瘤组织样品，例如肝、肾、脑等组织样品。在一个优选的实施方案中，所述样品是细胞样品，例如人肝癌细胞、大鼠肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人胚肾上皮细胞、人肾小管上皮细胞、人宫颈癌细胞等细胞样品，例如细胞的裂解液。在一个优选的实施方案中，所述的细胞为未经过裂解处理的细胞，例如为人芳香烃受体原位表达的细胞。在一个实施方案中，所述细胞为宫颈癌细胞，例如为HeLa细胞。在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体FlAhR-Ma4a6的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。

在另一个方面，还提供了一种试剂盒，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分。

在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体FlAhR-Ma4a。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体FlAhR-Ma4a6的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。

在另一个方面，还提供了本发明的抗体或其抗原结合部分在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测环境中能够激活人芳香烃受体的芳香烃类化合物，或者用于研究与人芳香烃受体相关的生物学或毒理学效应。

在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体FlAhR-Ma4a。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别根据本发明的抗体或其抗原结合部分，例如但不限于可特异性识别抗体FlAhR-Ma4a6的抗小鼠IgG抗体。在进一步优选的实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“人芳香烃受体(hAhR)”是本领域内熟知的，其是一种配基依赖性的转录因子。当配基与细胞质中AhR结合后，AhR被激活进而构象发生变化，暴露出入核序列，在入核序列的引导下进入细胞核，入核的AhR与芳香烃受体核转位蛋白及其它转录因子结合形成复合物，这些复合物进而调控细胞色素P450等基因的表达，从而产生多种健康效应和毒理学效应。此外，AhR还具有重要的生理学功能，例如维持免疫平衡，是膳食化合物与肠道免疫系统的感受器，它还能够影响肠道微生物种群，甚至能够提高肿瘤的逃逸。人芳香烃受体的示例性编码核苷酸序列如NP_001612.1所示，示例性氨基酸序列如下所示：

MNSSSANITYASRKRRKPVQKTVKPIPAEGIKSNPSKRHRDRLNTELDRLASLLPFPQDVINKLDKLSVLRLSVSYLRAKSFFDVALKSSPTERNGGQDNCRAANFREGLNLQEGEFLLQALNGFVLVVTTDALVFYASSTIQDYLGFQQSDVIHQSVYELIHTEDRAEFQRQLHWALNPSQCTESGQGIEEATGLPQTVVCYNPDQIPPENSPLMERCFICRLRCLLDNSSGFLAMNFQGKLKYLHGQKKKGKDGSILPPQLALFAIATPLQPPSILEIRTKNFIFRTKHKLDFTPIGCDAKGRIVLGYTEAELCTRGSGYQFIHAADMLYCAESHIRMIKTGESGMIVFRLLTKNNRWTWVQSNARLLYKNGRPDYIIVTQRPLTDEEGTEHLRKRNTKLPFMFTTGEAVLYEATNPFPAIMDPLPLRTKNGTSGKDSATTSTLSKDSLNPSSLLAAMMQQDESIYLYPASSTSSTAPFENNFFNESMNECRNWQDNTAPMGNDTILKHEQIDQPQDVNSFAGGHPGLFQDSKNSDLYSIMKNLGIDFEDIRHMQNEKFFRNDFSGEVDFRDIDLTDEILTYVQDSLSKSPFIPSDYQQQQSLALNSSCMVQEHLHLEQQQQHHQKQVVVEPQQQLCQKMKHMQVNGMFENWNSNQFVPFNCPQQDPQQYNVFTDLHGISQEFPYKSEMDSMPYTQNFISCNQPVLPQHSKCTELDYPMGSFEPSPYPTTSSLEDFVTCLQLPENQKHGLNPQSAIITPQTCYAGAVSMYQCQPEPQHTHVGQMQYNPVLPGQQAFLNKFQNGVLNETYPAELNNINNTQTTTHLQPLHHPSEARPFPDLTSSGFL(SEQ ID NO：23)

如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，人芳香烃受体)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如,scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体2E12)获得抗体的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。

如本文中所使用的，以编号提及的抗体与从相同编号的杂交瘤获得的单克隆抗体相同。例如，单克隆抗体FlAhR-Ma4a6是与从杂交瘤FlAhR-Ma4a6或其亚克隆或后代细胞获得的抗体相同的抗体。

如本文中所使用的，术语“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。

可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原(例如，人芳香烃受体)的结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。因此，可使用本领域技术人员已知的常规技术，获得与单克隆抗体FlAhR-Ma4a6竞争结合人芳香烃受体蛋白上的相同表位的抗体及其抗原结合部分。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以小于大约10^－6M，例如小于大约10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合抗原表位。

如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的单克隆抗体FlAhR-Ma4a6)以小于大约10^-6M，例如小于大约10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，人芳香烃受体蛋白)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。

如本文中所使用的，当提及术语“杂交瘤”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。例如，当提及杂交瘤FlAhR-Ma4a6时，其还指杂交瘤FlAhR-Ma4a6的亚克隆和后代细胞。

如本文中所使用的，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用合并入本文。

如本文中所使用的，术语“试剂盒”可以包括多种适于使用的存在形式，例如可以为盒装、瓶装、袋装等。

发明的有益效果

1)本发明提供的抗人芳香烃受体单克隆抗体能够识别多种细胞中人芳香烃受体的肽段VCYNPDQIPPENSPL，该识别位点区别于现有的商品化单抗的识别位点。

2)本发明的单克隆抗体分泌产量高、特异性强、灵敏度高、稳定性好，能应用于ELISA，免疫印迹(WB)，免疫沉淀(IP)和免疫荧光(IF)等多种免疫检测方法。

3)本发明的单克隆抗体不仅能够检测细胞裂解液中的人芳香烃受体，还能够检测细胞(例如HeLa细胞)中原位表达的人芳香烃受体，该优势将更有利于对芳香烃受体的活化过程的研究以及对原位芳香烃受体的定位、表征及分析。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及生物材料FlAhR-Ma4a6，其分类命名为单克隆细胞株，于2015年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCC No.10318。

附图说明

图1A免疫原GST-hAhR的鉴定；1B免疫原GST-hAhR纯度的鉴定；

图2单克隆抗体识别芳香烃受体片段的鉴定；

图3单克隆抗体亲和力的测定。横坐标为单抗的稀释倍数，纵坐标为单抗在OD450nm时的吸光度；

图4单克隆抗体识别不同细胞中芳香烃受体的鉴定结果；

图5单克隆抗体识别Hep G2中天然构象的AhR的结果；

图6单克隆抗体识别HeLa细胞中天然构象的AhR的结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1GST蛋白和GST-hAhR蛋白的制备

I.GST蛋白的表达

取转化后含有重组构建质粒pGEX4T-1(Promega)的BL21感受态细胞10μL接种于20mL Amp抗性的LB培养基中，37℃、180rpm活化过夜。然后1：50稀释到1L Amp抗性的LB培养液中，37℃、180rpm振摇培养至对数生长期OD600nm＝0.4-0.6，加入终浓度为0.5mM的ITPG，37℃、180rpm振摇诱导培养3h。4℃，4500rpm离心10min收集菌液沉淀。共收集2L的菌液沉淀。

II.GST蛋白的纯化

(1)裂解菌液沉淀：向离心后收集的菌液沉淀中加入6倍体积的1xPBS(30mL)和终浓度为2nM的蛋白酶抑制剂，混匀并进行超声波破碎，破碎条件如下:4℃冰浴下间断超声，超声20s,间歇1min,共6次，功率300w。待菌液较清亮时，添加终浓度为1％的PBS/10％TritonX-100混匀，冰上孵育1h。间隔10min混匀一次。孵育结束后13000rpm、4℃离心10mim收集上清。

(2)蛋白柱法纯化蛋白：上清先过琼脂糖凝胶4B柱子，流过琼脂糖凝胶4B柱子的滤液直接流经GST蛋白葡聚糖。用10倍体积的预冷的PBS洗脱葡聚糖柱子。用10mL还原型谷胱甘肽溶液洗脱蛋白。分10次洗脱，每次收集1mL。测定蛋白OD值。收集所有洗脱液，装在透析袋中置于1L1xPBS中，4℃条件下，透析2天。透析更换PBS的次序：1h换一次1xPBS，换3次；2h换一次1xPBS，换3次；8h换一次1xPBS，换5次。收集透析过的蛋白，测定浓度。

III.GST-hAhR蛋白的表达：

pGEX4T-1/hAhR质粒构建：5’端引物AACA GTCGAC TC atgaacagcagcagcgccaa(SEQ ID NO：2)，酶切位点Sal 1，3’端引物，AAAA GCGGCCGCTA caggaatccactggatgtca(SEQ ID NO：3)，酶切位点Not1，其中hAhR的序列参见NP_001612.1。取转化后含有重组质粒pGEX4T-1/hAhR的BL21感受态细胞10μL接种于20mL Amp抗性的LB培养基中，37℃、180rpm活化过夜。然后1:50稀释到1L含Amp抗性的LB培养基中，37℃、180rpm培养至对数生长期OD600nm＝0.4-0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃、180rpm诱导培养16h。4℃，4500rpm离心10min收集菌液沉淀。共收集10L的菌液沉淀。

IV GST-hAhR蛋白的纯化：

向离心后收集的菌液沉淀中加入6倍体积的1xPBS(30mL)和终浓度为2nM的蛋白酶抑制剂，混匀并进行超声波破碎，破碎条件如下:4℃冰浴下间断超声，超声1min、间歇20s，共9次，功率350w。待菌液较清亮时，添加终浓度为1％的PBS/10％TritonX-100混匀，冰上孵育1h。孵育结束后10000rpm、4℃离心15mim收集沉淀。向沉淀中加入15mL 1x loading buffer重悬，沸水浴10min。12000rpm 4℃离心20min收集上清，利用SDS-PAGE蛋白胶进行电泳。下层胶6％，上层胶5％，电压50V，电流400mA，功率10W过夜后，调至电压120V,电流400mA,功率10W。蛋白蓝色条带跑至玻璃板最下边缘终止。割取小部分竖条带胶条，进行考马斯亮蓝染色20min，将考染后的胶条复位，割取含有目的蛋白的大条带。加入2倍体积1xPBS研磨成粥状，完全混匀，置于4℃冰箱，3h后10000rpm，4℃离心10min，收集上清于新离心管中，4℃保存。再向沉淀中加入2倍体积1xPBS，4℃过夜。过夜后，4℃，10000rpm，离心10min，收集上清于新离心管中，将所有蛋白混合，用BSA测定浓度，分装后-20℃保存。用BSA测定浓度为0.5mg/mL。

V抗原GST-hAhR蛋白的鉴定及其纯度测定

采用BSA法测定GST蛋白的浓度为2.5mg/mL；GST-hAhR蛋白的浓度为0.5mg/mL。对于纯化的GST-hAhR蛋白采用Western Blot的方法进行鉴定(图1A)。对于纯化的GST-hAhR蛋白纯度采用考马斯亮蓝染色法进行鉴定(图1B)。利用商品化mouse AhR多克隆抗体M-20(Santa Cruz,CA,USA)对GST-hAhR蛋白进行鉴定，鉴定结果如图1A所示：上样蛋白GST作为阴性对照没有任何条带被检测到，同时作为阳性对照的上样蛋白为HeLa细胞的裂解液，在100kDa左右出现条带。这说明该多克隆抗体M-20能用于GST-hAhR蛋白的鉴定。在此条件下，在130kDa位置有明显的条带出现，说明纯化的蛋白含有GST-hAhR蛋白。在此基础上对GST-hAhR蛋白纯度进行了鉴定，鉴定结果如图1B所示。上样量为1μg的GST-hAhR蛋白条带在约130kDa位置，没有杂条带存在。符合作为免疫原的要求。

实施例2杂交瘤细胞的建立与抗芳香烃受体蛋白单克隆抗体的制备

I免疫动物

用制备的抗原GST-hAhR蛋白免疫6周大Balb/c雌鼠7只。Balb/c雌鼠的编号分别为：1#,2#,3#,4#,5#,6#和7#。取纯化后浓度为0.5μg/μL的可溶性蛋白GST-hAhR 280μL与1mL PBS和1.2mL福氏完全佐剂涡旋5min至完全混匀。充分乳化后，每只Balb/c雌鼠背部皮下多点注射0.48mL。之后每隔两周用福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂，其他实验条件不变进行第二次、第三次免疫。第三次免疫后一周小鼠尾部取血，测定血清效价(见表1)。

表1免疫小鼠血清效价的测定

测定血清效价1周后选取3#,6#和7#进行尾静脉注射加强免疫。将120μL GST-hAhR和1200μL无菌生理盐水混匀。每只Balb/c雌鼠注射0.4mL。加强免疫3天后取脾细胞进行融合。

II杂交瘤细胞的制备

1.饲养层细胞的制备

(1)未免疫的健康6周龄Balb/c雌鼠断颈处死后，浸泡于75％酒清5分钟，之后置于超净台固定板上。

(2)轻轻按摩腹部促进腹腔巨噬细胞释放，用无菌剪刀分离皮肤和腹膜，在腹腔部位剪开一个小口，用吸管向腹腔内加入3mL含HAT的RPMI1640选择性培养基，吸出腹内细胞液，再用适量HAT培养基冲洗腹腔5次。

(3)用该HAT培养基稀释腹腔冲洗液至20mL，滴加到96孔板内，每孔100μL，约含2xl0⁴个细胞，一只小鼠制备3块96孔板，一次融合实验共制备12块96孔板，放入37℃，5％CO2培养箱内过夜培养，以备次日融合实验使用。

2.骨髓瘤细胞的准备

采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(北京协和细胞资源中心)进行融合，准备融合前两周复苏SP2/0，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3-6月应用8-氮-鸟嘌呤筛选一次，以防止细胞的突变。在SP2/0融合前36小时扩大培养，融合当天细胞处于对数生长期。

(1)直接将SP2/0从培养皿中轻吹下，收集到新的50mL离心管中，室温1500rpm离心7min。

(2)倾倒上清后，用无血清1640培养基重悬并定容至20mL，再室温1500rpm离心7min。

(3)重复(2)一次。

(4)倾倒上清后，再用无血清1640定容至20mL重悬，置于37℃，5％CO2培养箱内备用。稀释10倍，100倍后进行细胞计数并测定细胞活性，活细胞数高于95％为合格；

3.免疫小鼠脾细胞的制备

(l)3#,6#和7#Balb/c小鼠加强免疫3天后，取其脾细胞进行融合。Balb/c小鼠眼球取血，收集血液室温静置4h后，室温2000g，离心20min，收集上清冻存，做为抗体检测时的阳性对照使用。

(2)取血后颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75％酒精中消毒5min。固定于超净台解剖台上，剪开左侧腹部皮肤，剪开腹膜，用无菌手术取脾，放入盛有无血清1640培养基的无菌平皿内，轻轻洗涤，并小心除去脂肪及结缔组织，再移到另一只盛有无血清1640培养基的无菌平皿内，用剪刀在脾脏上剪几个小口，放在细胞筛内，先用灭菌玻璃注射器内芯碾压脾脏，使脾细胞释放到平皿中的清理液中，用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。室温1500rpm离心7min。

(3)倾倒上清后，加入20mL无血清1640培养基重悬，备用。稀释10倍，100倍后进行细胞计数并进行细胞活性测定。活细胞数高于80％为合格。

4.细胞融合及HAT选择杂交瘤

(l)取SP2/0细胞及脾细胞，两种细胞按1:5的比例混合于50mL离心管中，室温1000rpm离心5min。

(2)小心去除上清液，轻弹管底使细胞颗粒群松散。

(3)在1min内，缓慢加入37℃预热的1mL 50％PEG1500(晶状固体灭菌后用无血清1640培养基配制)融合剂，边滴加边轻轻旋转振荡离心管，使其充分混匀，室温静置l.5min。

(4)静置后，在2.5min内加入5mL无血清1640培养基，之后再静置5min。

(5)静置后，加入10mL无血清1640培养基，用手指轻振离心管，使细胞混匀。室温1000rpm离心5min。

(6)离心后倾倒上清，加入10mL含HAT和10％FBS的1640培养基混匀，之后再补足定容30mL，混匀。将融合后的细胞悬液滴加到准备好饲养层细胞的96孔板上每孔加入100μL。最后将融合细胞培养板放置37℃、5％的CO2培养箱中培养。

(7)融合三天后观察融合情况，并向每孔中补加2-3滴含HAT的10％FBS的1640培养基至孔的3/4体积处。

(8)融合6天后,用含HAT的10％FBS的1640培养基半量换液，至第10天时全部换用含HT的10％FBS的1640培养基。记录融合细胞的生长情况，待杂交瘤细胞生长至孔底面积1/4以上时，吸取上清进行抗体检测。

5.杂交瘤阳性克隆的筛选

待融合后的细胞生长到覆盖细胞孔底部1/4-1/3时，用免疫原GST-hAhR蛋白和GST蛋白作为包被抗原进行间接ELISA方法筛选阳性孔。筛选出只能识别GST-hAhR蛋白而不识别GST蛋白的阳性孔。按确定的最佳抗原浓度包被，用已建立的间接ELISA方法检测2次(第一次检测前应保证全部换液，防止培养液中的抗体由未死亡的脾细胞分泌导致假阳性；检测2天后进行第二次检测)。取样时从含有融合细胞的孔中吸取100μL上清后，原孔内补加等量1640完全培养基，阳性对照孔为免疫小鼠的血清，阴性对照为SP2/0细胞上清，100mL/孔，37℃温育60min。2次检测均为阳性的细胞孔为阳性孔，对其进行克隆；2次检测中只有一次为阳性的细胞孔为可疑孔，3天后再检测一次，如仍为阴性则弃之；2次检测均为阴性的孔为阴性孔，直接弃去。阳性杂交瘤细胞的克隆检测为阳性的细胞孔应尽快采用有限稀释法进行克隆化培养。

6.阳性杂交瘤细胞的亚克隆

检测为阳性的细胞孔尽快采用有限稀释法进行亚克隆化培养。

(1)亚克隆前制备饲养细胞，方法如前面所述。

(2)用完全培养基将阳性孔中的融合细胞轻吹打，吸到无菌2mL离心管中，取少量进行细胞计数。

(3)用含10％FBS,1％HT选择性1640培养基稀释阳性杂交瘤至10个/mL。

(4)将稀释好的细胞悬液(三种稀释度)滴加到有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，每一种稀释度加96个孔。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养，观察生长情况，4d左右确定单克隆细胞株并半量换液一次培养。待克隆细胞生长至8-10天时，细胞长满孔底大概1/10，检测上清，标出单克隆阳性孔。

(5)将两次检测OD450nm值高的孔进行细胞计数，开展下一轮有限稀释和克隆化培养，如此进行3次亚克隆，直到所有的孔都为阳性。

(6)最后选择相对OD450nm值高、细胞活力好，并且能稳定分泌抗体的细胞的孔。

(7)细胞融合一次共获得1株能稳定分泌抗体的细胞株，即可分泌抗人芳香烃受体蛋白单抗的杂交瘤细胞，命名为FlAhR-Ma4a6。该杂交瘤细胞于2015年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号CGMCC No.10318(FlAhR-Ma4a6)。

7.细胞冻存

细胞冻存液所含胎牛血清的量为90％，冻存液中含10％的DMSO；细胞浓度为10⁷个/mL；细胞冻存管放入冻存盒后放入-80℃，几天后转入液氮中长期保存。

8.细胞复苏

从液氮罐中取出冻存管，立即放37℃水浴中速溶1min；400g离心3min，无菌操作打开冻存管，弃上清，细胞用HT培养基重新悬浮，取出细胞悬液，转入细胞培养皿；培养箱中培养，2小时后吸掉培养上清，加入新的培养基培养。

实施例3单克隆抗体的制备

1.含单克隆抗体的小鼠腹水的制备

(l)选取6周龄健壮的Balb/c雌鼠，提前1周腹腔注射0.2mL降植烷(Sigma)进行预处理。

(2)将生长良好杂交瘤细胞的细胞轻吹下，收集，l000r/min离心3min，重悬于无菌NaCl注射液，计数备用。

(3)每只小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞5x10⁵个。

(4)杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。10-14天可见小鼠腹部膨大,收集腹水。

(5)断颈处死小鼠取腹水，在5mL管内加入50μL 2％Procline300。吸出的腹水放于5mL离心管内，上下颠倒混匀。将腹水5000rpm离心l0min，收集上清并滤纸过滤，过滤液保存于-20℃，准备纯化。

2.单克隆抗体的纯化

(1)室温溶解-20℃保存的腹水，12000rpm、4℃离心10min，收集上清。上清首先流经琼脂糖凝胶4B柱子，冲洗琼脂糖凝胶4B柱子，流过琼脂糖凝胶4B柱子的滤液直接流经protein A/G蛋白柱。1xPBS冲洗琼脂糖凝胶4B柱子至无色。收集流经protein A/G柱子的过滤液重复过滤1次。

(2)用1xPBS冲洗protein A/G蛋白柱直至过滤液在OD280nm下的吸附值达到基线为止。

(3)在洗涤柱子的同时，准备1.5mL的灭菌EP管，在每个收集管里加入150μL 1M Tris-HCl pH＝8.0。PBS流尽后，用50Mm NaAc pH＝3.0进行洗脱抗体，每次洗脱体积1mL并收集于加入Tris-HCl的EP管中，收集结束立刻上下颠倒EP管进行混匀。洗脱液为中性为止。然后将洗脱好的抗体放置于冰上。用1xPBS于4℃透析。通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，-80℃分装保存。

实施例4单克隆抗体效价的测定

效价数据采用间接ELISA法，具体步操为：

(1)包被：用pH＝9.6的碳酸钠缓冲液，将BSA,GST-hAhR分别稀释成1pg/mL，以100μL/孔加入96孔板中，并在4℃条件下包被过夜。

(2)封闭：用1％的BAS封闭，200μL/孔，置于37℃恒温箱中孵育1h,用TBS-1％Tween20洗板3次，最后甩干。

(3)孵育一抗：将单抗进行500、2000、8000、32000、128000、512000倍系列浓度稀释，100μL/孔，至少做3个平行，并设置空白对照，在4℃条件下孵育过夜；再用TBS-1％Tween 20洗板3次，最后甩干。

(4)孵育二抗：将HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(Invitrogen)进行10000倍稀释，100μL/孔，在37℃条件下蜉育1h。用TBS-1％Tween 20洗板3次后，最后甩干。

(5)显色反应：加入TMB底物缓冲液100μL/孔，在37℃条件下孵育30min。

(6)终止反应并读数：用1mol/L H2SO4100μL/孔终止反应，酶标仪读取OD450值。测定结果:当FlAhR-Ma4a6的浓度为0.79mg/mL时，效价为409600。

实施例5单克隆抗体亚类鉴定

采用美国Sigma公司的鼠单抗亚型测定试剂盒。标准血清是羊抗鼠IgGl,IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA,IgM。利用间接ELISA法测定单克隆细胞株分泌到培养基中抗体的亚型。具体操作步骤如下：

(1)用0.05mol/L pH＝9.6碳酸盐缓冲液包被ELISA板，每孔100μL。

(2)脱脂奶封闭，每孔200μL，37℃孵育1h后，TBS-0.05％Tween洗涤3次，每孔200μL。

(3)取单克隆细胞株培养基上清加入96孔板，100μL/孔，37℃孵育1h后，TBS-0.05％Tween洗涤3次

(4)用PBS分别稀释1000倍标准羊抗鼠血清，100μL/孔。室温孵育30min后，TBS-0.05％Tween洗涤3次。

(5)用TBS-0.05％Tween稀释5000倍辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG。100μL/孔。室温孵育15min后，TBS-0.05％Tween洗涤3次。

(6)加入TMB100μL/孔。37℃孵育30min后,加入1M H2SO4100μL/孔终止反应。酶标仪测定OD450值。选取OD450值最大的为抗体的亚型。测定结果:FlAhR-Ma4a6的亚型为IgG2a。

实施例6单克隆抗体识别芳香烃受体蛋白氨基酸序列的鉴定

1.单抗识别hAhR蛋白片段的鉴定

(1)构建GST-hAhR蛋白片段载体

1)引物设计。依据hAhR序列(NP_001612.1)，将其分为8个基因片段，命名为hAhR-1-114；hAhR-113-224；hAhR-219-312；hAhR-309-408；hAhR-403-523；hAhR-519-628；hAhR-622-734和hAhR-729-823。根据每个片段的序列特征设计引物，并引入Bam HI及Xho l位点，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。设计引物如表2。

表2构建不同芳香烃受体蛋白片段的引物列表

2)构建重组载体。采用常规PCR方法分别从pGEX4T-1/GST-hAhR载体中扩增8个目的片段。pGEX4T-1经Bam HI及Xho l双酶切，琼脂糖凝胶回收。将8个目的片段分别与双酶切后的回收pGEX4T-1片段酶联，构建重组载体。重组载体信息如表3。

表3构建不同芳香烃受体蛋白片段的大小

(2)表达目的蛋白。将构建的重组载体转入感受态细胞BL21，IPTG诱导表达目的片段蛋白。

(3)Western Blot鉴定单抗识别目的片段蛋白。跑变性胶SDS-PAGE：上层胶5％，下层胶10％，上样量2μL，电压80-100V。转膜：PVDF膜，电压100V，电流250mA，时间1.5h。单抗1μg/mL，二抗1:10000稀释。

鉴定结果如图2所示。FlAhR-Ma4a6单抗识别V2,即hAhR蛋白的氨基酸序列为113-224。

2.单抗识别合成短肽氨基酸序列的鉴定

间接ELISA法测定单抗识别合成多肽。

(1)短肽的设计。根据分段表达蛋白WB鉴定实验结果，hAhR蛋白免疫优势区域位于V1,V2,V5,V6,V7和V8载体中，为对这些区域进行抗原表位的鉴定。根据hAhR蛋白氨基酸序列的抗原性和亲水性设计一系列免疫优势区并且部分重叠的15个氨基酸的16条短肽。多肽命名及序列见下表4。

表4鉴定单克隆抗体识别具体肽段合成的多肽段列表

(2)间接ELISA法。短肽用pH＝9.6的NaHCO3配制浓度为10μg/mL，100μL/孔。4℃铺板16h；之后，用5％milk 37℃封闭1h；单抗用1％BSA-TBS-0.1％Tween20配制浓度为0.5ug/mL，100μL/孔。4℃铺板16h；二抗1：10000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。

测定结果如表5所示。FlAhR-Ma4a6单抗识别hAhR蛋白的肽段为VCYNPDQIPPENSPL(SEQ ID NO：1)。

表5单克隆抗体识别具体肽段的结果

实施例7单克隆抗体亲和力鉴定

1.利用方阵滴定法确定抗原和酶标记物的最佳稀释度

将抗原合成肽段(VCYNPDQIPPENSPL)用包被液稀释成1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml进行包被,100μl/孔,4℃过夜。取出用PBST洗板3次,拍干；用5％的脱脂奶粉以100μl/孔加入,37℃封闭1小时,洗板3次,拍干；然后将阴、阳性血清(未免疫的Balb/c雌鼠的血清为阴性血清、用hAhR蛋白免疫的Balb/c雌鼠的血清为阳性血清)用稀释液按本实验室的参考浓度(1∶1000)进行稀释,100μl/孔,37℃反应30分钟,洗涤3次,拍干,同时设空白对照；酶标二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG的二抗，Invitrogen)用稀释液按1∶0.5×10⁴、1∶0.75×10⁴、1∶1×10⁴、1∶2×10⁴进行稀释,然后100μl/孔加入,37℃反应30分钟,洗涤3次,拍干；加入TMB(四甲基联苯胺)底物溶液100μl/孔,37℃反应10分钟；最后加入100μl/孔硫酸(1mol/L)

2.单克隆抗体相对亲和力的测定

用确定的抗原和酶标记物的最佳稀释度条件，选定1μg/ml稀释的抗原浓度为最佳包被浓度,以1∶0.75×10⁴稀释的酶标二抗测定单抗相对亲和力的最佳工作浓度，对单抗进行相对亲和力的测定,以单抗的稀释度与其相对应的OD450nm值作图,曲线趋于平坦时的OD450nm作为100％,即抗原与单抗的结合已达到饱和状态(见图3)。取曲线上50％饱和度所对应的单抗浓度,即为该株单抗的相对亲和力。通过测定FlAhR-Ma4a6的相对亲和力是0.713μg/ml。

实施例8单克隆抗体应用于识别不同细胞系中AhR蛋白的氨基酸序列

(1)蛋白样品准备：人肝癌细胞(Hep G2细胞)，大鼠肝癌细胞(H4IIE细胞)，人肾小管上皮细胞(HKC细胞)，人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)，人胚肾上皮细胞(293T细胞)和人宫颈癌(HeLa)细胞生长至细胞密度到90％(10cm细胞培养皿)，去除培养基，用预冷的1xPBS洗2次。每个细胞培养皿加入1mL裂解液，冰上操作，贴壁细胞用细胞刮子刮下，连裂解液一同转移至新的预冷的离心管中。置于4℃摇床平台上，中速振荡10min。之后14000rpm，4℃离心15min，取上清为全蛋白提取物。各细胞蛋白提取物加入5xSDS上样缓冲液，沸水浴7min。

(2)SDS-PAGE电泳：配制上层为5％，下层为10％的1.5mm的胶。蛋白上样量分别为40μL。浓缩胶电压设定为80V，分离胶电压设定为，100V。

(3)转膜：采用NC膜。转膜恒定电压100V，电流250mA，2h。

(4)封闭：Odessy封闭液室温封闭2h。

(5)孵育一抗：用Odessy封闭液稀释FlAhR-Ma4a6单抗2μg/mL和商品化抗体B-11(2μg/mL)(Santa Cruz)，4℃孵育过夜。之后用PBS-0.1％Tween20洗涤3次，10min/次。

(6)孵育二抗：用PBS-0.1％Tween 20和用Odessy封闭液(1:1v/v)稀释10000Donkey anti-mouse IR DyeR680CW。室温孵育50min(避光)。之后用PBS-0.1％Tween 20洗涤3次，10min/次。

(7)扫膜：用进口双色红外激光成像系统(ODYSSEY LI-COR)进行扫膜。

实验结果如图4所示，单克隆抗体FlAhR-Ma4a6能够识别这6种不同细胞系表达的芳香烃受体蛋白。

实施例9单克隆抗体FlAhR-Ma4a6用于识别Hep G2表达的AhR蛋白(IP)

采用IP的方法检测单抗识别HepG2表达的hAhR蛋白，并用商品化AhR抗体B-11做IB进行鉴定。

(1)清洗蛋白结合珠子protein A/G：取40μL protein A/G于1.5mL离心管中，每管加入800μL TBS-1％Tween-20(预冷)，4℃，2000rpm离心2min。共清洗4次。

(2)protein A/G与单抗孵育：向清洗后的protein A/G中加入8μg单抗FlAhR-Ma4a6于层析柜(4℃)中孵育2h。

(3)制备细胞裂解液：生长至对数生长期的Hep G2弃培养基用预冷的PBS清洗2次后置-30℃备用(时间不超过2周)。每10cm皿加入1mL TBS-1％Tween-20(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解15min(每5min混匀裂解1次)后，收集细胞于离心管中，冰上继续裂解45min。裂解结束后，分装于1.5mL中，4℃，13300rpm，离心15min，收集上清。单抗结合细胞裂解液中的AhR蛋白：protein A/G与单抗FlAhR-Ma4a6孵育结束后，用TBS-1％TWEEN-20(预冷)清洗4次后，每管中加入250μL细胞裂解液。置于层析柜(4℃)中孵育2h。

(4)准备蛋白胶上样样品：B-11与裂解液孵育结束后，4℃，2000rpm离心2min。上清收集至离心管中，备用。之后清洗蛋白结合珠子4次。每个蛋白结合珠子离心管中加入20μL,2.5x BMF；分别取本步骤离心后的上清和步骤3中的细胞裂解液40μL与10μL 5X的BMF混合；同时用0.8mL，2x的上样缓冲液直接裂解10cm皿的细胞。将所有样品沸水浴7min。

(5)蛋白电泳：SDS-PAGE 8％60-100V。上样顺序和上样量如下

(6)转膜：采用PVDF膜，100V，250mA，转膜1.5h。

(7)封闭：10％牛奶孵育1h。

(8)孵育一抗：B-11：2μg/mL(用2.5％牛奶稀释)，4℃层析柜孵育过夜。

(9)孵育二抗：HRP标记的羊抗鼠的二抗(Invitrogen)1:10000稀释，室温孵育50min。

(10)曝光底物显色：将A，B液混合后，加到PVDF膜上，静置5min。显色后曝光。

(11)显影获得实验结果。

实验结果如图5所示，单克隆抗体FlAhR-Ma4a6能够识别HepG2中表达的芳香烃受体蛋白。

实施例10单克隆抗体应用于识别HeLa原位表达的AhR蛋白的天然构象(IF)

(1)细胞接种：实验前1天将HeLa细胞种于35mm小皿中。

(2)固定细胞：吸走培养基，1×PBS洗两遍，按照500μl/孔固定液(含4％多聚甲醛和4％蔗糖)室温固定细胞，15min。然后弃掉固定液，1×PBS洗三遍。

(3)防淬灭：向细胞中加入50mM NH4Cl，覆盖细胞，4℃放置1h。

(4)穿孔：吸走NH4Cl，加入0.1％Triton-100，室温放置10min。(这一步可以不用PBS洗)

(5)封闭：加入5％BSA，300μl/孔，室温，以水平摇床最慢速度放置1h。期间准备一抗，1:100稀释(NF200，1/10western抗体量)。然后，1×PBS洗两遍，尽量去除残留液体。

(6)孵育一抗：一抗(单抗FlAhR-Ma4a6和商品化抗体L-15(Santa Cruz)浓度均为10μg/mL)用BSA稀释。轻轻加入100μl一抗，盖上封口膜，4℃孵育16h。去掉一抗，加入1×PBS，室温摇床5min，重复三遍。

(7)孵育二抗：AlexaFluor 488标记的驴抗鼠的二抗(Invitrogen)用BSA稀释，DAPI稀释倍数为10000。加入100μl二抗和DAPI混合液。室温放置1h，避光然后用1×PBS洗三遍，吸干。

(8)显微镜下观察及分析结果。

实验结果如图6所示，单克隆抗体FlAhR-Ma4a6能够识别HeLa细胞质中表达的天然构象的芳香烃受体蛋白，而商品化抗体L-15对细胞质中的天然构象的芳香烃受体蛋白识别不理想，这表明由于FlAhR-Ma4a6识别特定的表位因而更容易识别细胞质中原位表达的天然构象的芳香烃受体蛋白。而FlAhR-Ma4a6在识别原位表达的天然构象芳香烃受体方面的优势将更有利于对芳香烃受体的活化过程的研究，及原位芳香烃受体的定位、表征及分析。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。