技术领域：本发明属于基因组DNA提取领域，具体涉及一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法和试剂盒。
背景技术：
：土壤甲螨等是小型节肢动物，个体通常小于1mm，这种小型节肢动物的鉴定一般是通过对其制作玻片标本后进行鉴定，这种方法专业性强，鉴定难度大，随着DNA条形码技术的发展，几乎所有主要的动物类群都在构建所选择基因区域(如COⅠ)的综合序列数据库，并建立相应的凭证标本馆藏。根据常规的DNA提取方法，获得小型节肢动物的DNA条码需要对整个个体进行研磨，从而破坏了小型节肢动物个体的形态，造成凭证标本不能保存或不能完整的保存，如果将几个甚至几十个个体混在一起，又很难保证DNA模板来源的单一性，为后续的结果分析带来很大的麻烦。近来，越来越多的学者也在不断摸索针对微小节肢动物个体的新的DNA条码获取方法，有些报道通过将微小节肢动物个体整只进行裂解，以获得DNA条码并达到凭证标本不被破坏的目的，但是很多微小节肢动物个体具有很厚的几丁质保护壳，例如土壤甲螨，如果不研磨，只通过裂解液很难获得足够浓度的DNA模板。目前，具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的DNA条码获得方法相关发明未见公布，因此很有必要研究一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的DNA条码获得方法和试剂盒。几丁质酶的作用是降解几丁质的糖苷酶，以往的研究中，大多数都是对几丁质酶的基因结构、几丁质酶在植物病害防治中的作用或利用几丁质酶测定活性等方面的研究，未发现有利用几丁质酶消化小型节肢动物几丁质壳并用于基因组DNA提取的报道。
技术实现要素：
：本发明的目的是提供一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法和试剂盒，利用该方法既能获得较高质量DNA模板和保证模板DNA的单一来源性又能保证凭证标本不被破坏，同时与以往的形态鉴定相比能大大减少对形态专家的依赖性，减少主观性，提高鉴定的准确性。本发明的具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取方法，其特征在于，将具厚几丁质外壳微小节肢动物用几丁质酶处理后，然后加入裂解液中裂解后，获得基因组DNA。优选，所述的裂解液为：100～900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。优选，是将具厚几丁质外壳微小节肢动物放置于含1mg/ml几丁质酶的pH6.0磷酸缓冲液中，25℃消化24小时，然后将消化后的具厚几丁质外壳微小节肢动物放置于裂解液中，56℃裂解24h，获得基因组DNA，所述的裂解液为：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。本发明的第二个目的是提供一种具厚几丁质外壳微小节肢动物无损伤凭证标本的基因组DNA提取试剂盒，包括DNA提取试剂，其特征在于，还包含几丁质酶工作液和裂解液。优选，所述的裂解液为：100～900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。优选，所述的几丁质酶工作液是含1mg/ml几丁质酶的pH6.0磷酸缓冲液，所述的裂解液为：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。所述的DNA提取试剂盒中优选还包括洗液A(TIANampGenomicDNAkit，Cat：DP304-02中GD)，洗液B(TIANampGenomicDNAkit，Cat：DP304-02中PW)、正向引物LCO14905’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’、反向引物HCO21985’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’、dNTP、含Mg2+的10×Buffer和Taq酶。利用本发明的方法和试剂盒可以既能获得较高质量DNA模板和保证模板DNA的单一来源性又能保证凭证标本不被破坏，同时与以往的形态鉴定相比减少对形态专家的依赖性，减少主观性，提高鉴定的准确性，具有广泛的应用前景。附图说明：图1是土壤甲螨未用几丁质酶消化直接裂解扩增电泳图，其中M：分子量标准，—：阴性对照，1-6：甲螨样品；图2是土壤甲螨用几丁质酶(1mg/ml)消化4h后再进行裂解扩增电泳图，其中M：分子量标准，—：阴性对照，1-6：甲螨样品；图3是土壤甲螨用几丁质酶(1mg/ml)消化8h后再进行裂解扩增电泳图，其中M：分子量标准，—：阴性对照，1-6：甲螨样品；图4是土壤甲螨用几丁质酶(1mg/ml)消化24h后再进行裂解扩增电泳图，其中M：分子量标准，—：阴性对照，1-6：甲螨样品；图5是扩增序列在BOLD上比对结果。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：(1)厚几丁质外壳微小节肢动物几丁质壳的消化用PH6.0磷酸缓冲液将几丁质酶(Sigmachitinasefromstreptomycesgriseus,货号C6137-5UN)配成浓度为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml的酶溶液，取100微升加入放有甲螨的1.5ml离心管中(每个处理6个样本，每个样本的几丁质酶消化阶段和之后的裂解都是单只进行的)，在25℃金属浴中分别消化4h、8h、24h，以不含几丁质酶的PH6.0磷酸缓冲液的处理作为对照。选取最佳浓度和处理时间。(2)厚几丁质外壳小型节肢动物基因组DNA的获得将步骤(1)中几丁质酶消化过的甲螨取出，每只单独放入一新1.5ml离心管中，加入200微升自配裂解液，56℃裂解24h，获得基因组DNA。自配裂解液配方：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水，其配制方法是按其成分及含量将所有成分混合均匀即可。(3)使用如下引物进行PCR，以步骤(2)的基因组DNA作为DNA模板，PCR的反应条件为：94℃变性5min；94℃40S、50℃40S、72℃1min，29个循环；72℃延伸10min；得到PCR产物；正向引物Lco1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；反向引物Hco2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。该对引物扩增得到的PCR产物的序列如SEQIDNO.1所示。(4)将PCR产物进行电泳分析，并将扩增出的目的条带进行测序，测序得到的结果放到BOLD(http://www.barcodinglife.org/)网站进行序列比对。PCR产物的电泳图如图1-图4所示，统计分析如表1所示。表1注：+代表扩增出阳性条带的样本个数，-代表扩增出阴性条带的样本个数。从图1-图4和表1可以看出，土壤甲螨未用几丁质酶消化直接裂解，未能扩增出PCR产物。而低浓度的几丁质酶处理组，随着处理时间的增加，其扩增出的阳性条带的样本数增加，高浓度的几丁质酶处理组，在处理时间比较短的情况下，其扩增出的阳性条带的样本数比较多，最适浓度为1mg/ml，最佳处理时间为24小时，最适温度为25℃。扩增出的阳性条带送去测序，其序列都如SEQIDNO.1所示，与目标序列一致。序列的比对结果如图5所示。(5)实验用完小型节肢动物制成玻片作为凭证标本。由此可见，本发明的方法既能获得较高质量DNA模板和保证模板DNA的单一来源性又能保证凭证标本不被破坏，同时与以往的形态鉴定相比减少对形态专家的依赖性，减少主观性，提高鉴定的准确性。实施例2：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：100mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例3：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：200mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例4：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：300mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例5：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：400mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例6：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：500mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例7：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：600mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例8：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：700mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例9：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：800mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。实施例10：本实施例与实施例1基本相同，只是自配裂解液配方为：900mMGuSCN、30mMEDTAPH8.0、30mMTris-HClPH8.0、质量分数0.5％TritonX-100、质量分数5％Tween-20，溶剂为水。按照本实施例的提取方法提取得到的基因组DNA经电泳分析，结果表明都扩增出的目的条带。