一种玉米转化事件及其特异性鉴定方法和应用与流程

本发明属于植物分子生物学领域，特别是转基因农作物品种培育领域。本发明涉及具有抗虫抗草甘膦玉米转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”及其特异性检测方法。

(二)

背景技术：

玉米(Zea mays)是一种重要的作物，是世界上很多地区的主要食物来源。随着植物基因工程的发展，通过导入外源基因来进行遗传改造成为遗传育种的主要手段之一。在玉米生产中，抗虫和抗除草剂都是非常需要的农艺性状。抗虫转基因玉米能够大幅度地降低化学杀虫剂的使用量，从而降低生产成本并且减少农药对环境和农作物产品的污染。抗除草剂玉米可以大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力的投入，减少杂草对玉米产量的影响。此外，利用除草剂防治杂草也更加有利于推广免耕技术，减少土壤和肥料的流失。因此抗虫和抗除草剂性能在玉米生产中具有突出的重要性。

转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。

目前并不清楚外源基因在植物中的插入位点整合规律，因此研发过程中需要产生大量转化体并从中筛选理想的转化事件。通常需要产生数百乃至数千的不同转化事件，并在这些转化事件中筛选出具有预期转基因表达水平和模式的单一转化事件。利用育种方法、体细胞原生质融合技术可以将该转化事件导入到不同遗传背景的玉米基因组中，从而赋予玉米抗虫抗草甘膦的能力。

通过转化事件专利对转基因农作物进行知识产权保护是目前国际上通用方法，能够进入商业化的转化事件是从大量转化事件中筛选鉴定获得，外源基因与受体作物基因组特异位点整合，具有独特的分子特征，同时外源基因表达规律与生产实际需要相吻合，在基因分子特征和表达规律上都与一般转化事件不同，因此具有明显的新颖性、实用性和创造性。目前，国际上商业化的转化事件多获得知识产权保护，部分转化事件在中国申请并获得专利保护。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供优良的玉米抗虫抗草甘膦转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”，这两个独立转化事件所含外源基因的设计构思相同，是同个植物转化载体侵染玉米后，通过筛选获得的优良转化事件，这两个转化事件都可实现将外源基因引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因外源基因在受体玉米中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体玉米的农艺性状不会产生不良影响。

本发明提供一种玉米转化事件，所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区或者以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区。所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘膦基因，所述抗虫基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述抗草甘膦基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

进一步，优选所述外源基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，优选所述玉米转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区，即本发明提供抗虫抗草甘膦玉米转化事件“双抗12-5”，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.2、插入序列左侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.1和插入序列右侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.3构成。

进一步，所述玉米转化事件以SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼区，以SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼区，即本发明提供抗虫抗草甘膦玉米转化事件“双抗12-15”，其特征DNA序列由外源T-DNA插入序列SEQ ID NO.2、插入序列左侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.14和插入序列右侧翼区玉米基因组序列SEQ ID NO.15构成。

本发明所述玉米转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”是利用农杆菌侵染法，将含有抗虫抗草甘膦基因表达框的外源T-DNA序列导入玉米细胞中，通过再生含有外源基因的玉米细胞获得玉米转基因群体，并利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到能够满足生产需要的玉米转化事件。

本发明提供的外源T-DNA含有抗虫基因表达框和抗草甘膦基因表达框。

本发明提供的抗虫基因表达框由玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)、抗虫融合基因cry1Ab-cry2Aj和玉米PEP carboxylase基因(pepc)终止子构成。其中玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)大小为2.1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.7，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。PEP carboxylase基因(pepc)终止子，来源于玉米，大小为0.2kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.8。

进一步，所述抗虫基因是cry1Ab和cry2Aj的融合基因，核苷酸序列为SEQ ID NO.4，其中，1-1947bp为cry1Ab的核苷酸序列；1948-1965bp核苷酸序列为CCCGGGAAGGGTGGAGGA，编码Cry1Ab和Cry2Aj之间的连接肽，连接肽序列为PGKGGG；1966-3861bp为cry2Aj改良基因的核苷酸序列。融合基因全长为3861bp，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。所编码的蛋白质由1287个氨基酸残基组成，蛋白分子量大小为142.8kDa。Cry1和Cry2是两类被广泛应用的抗虫基因，其中Cry1Ab，Cry1Ac，Cry1F和Cry2Ab等在玉米、棉花中已经大规模推广应用，Cry1Ab是一种杀虫能力比较强的Bt晶体杀虫蛋白质，特别是其对玉米螟的杀虫活性尤为高。Cry2Aj对主要农作物鳞翅目害虫具有比较高的杀虫能力，与目前生产大量推广的Cry2Ab的杀虫谱比较接近，氨基酸序列也比较相似。这些基因的安全性和抗虫能力已经得到充分证明。本发明使用了cry1Ab和cry2Aj的融合基因，其特点是同时利用两种不同的抗虫Bt基因，并且它们在玉米中表达量相同。目前的研究认为，二个不同类型抗虫基因同时表达有可能减缓害虫抗性的发生(Zhao et al.,2003,Nat.Biotechnol.21:1493-1497)，有利于抗虫转基因玉米的长期有效利用。

本发明提供的抗草甘膦表达框是由花椰菜花斑病病毒(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)的35S启动子和玉米polyubiquitin-1基因启动子组成的复合启动子(p35S-pZmUbi-1，核苷酸序列为SEQ ID NO.9)，5’端连有一段编码AHAS基因叶绿体信号肽的G10evo(EPSPS)(核苷酸序列为SEQ ID NO.5，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.10)和CaMV的35S基因终止子(SEQ ID NO.11)构成。

进一步，所述抗草甘膦基因是5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因。草甘膦是一种广谱灭生性除草剂，它通过抑制植物中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性，导致植物不能合成芳香族氨基酸而死亡。为了方便杂草控制，通过在作物转入对草甘膦具有抗性的EPSPS可以使作物获得抗草甘膦的能力，实现在农作物生长的同时选择性地除草。

本发明还涉及一种含玉米转化事件的重组载体，其含有本发明所述T-DNA插入序列。在一个实施方案中，所述载体图谱如附图1所示，载体序列为SEQ ID NO.13。

本发明提供一种含玉米转化事件的重组细胞，重组细胞中含有本发明所述的重组载体。在一个实施方案中，所述重组细胞为含有本发明所述重组载体的重组农杆菌细胞。

本发明提供用于检测转化事件“双抗12-5”的引物对，所述引物对由特异性识别T-DNA插入序列的第一引物和任意特异性识别SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物序列为：SP1或R1，所述第二引物序列为：RB-Test或LB-test。

本发明提供一种鉴定玉米转化事件“双抗12-5”的方法，其包括：

1)从待鉴定的玉米样品提取基因组DNA；

2)以提取的DNA样品为模板，使用本发明提供的引物对进行PCR扩增；

3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与转化事件上所述PCR引物对的序列之间的理论长度一致，则说明所述样品中含有“双抗12-5”。

本发明还提供一种玉米转化事件“双抗12-5”特异性的PCR鉴定方法，所述用于玉米转化事件“双抗12-5”特异性PCR鉴定的引物(SP1和RB-Test是检测外源基因右侧是否与玉米基因组特异性位点连接，R1和LB-test是检测外源基因左侧是否与玉米基因组特异性位点连接)为：

SP1：5’-TTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3’(SEQ ID NO.17)；

RB-Test：5’-CTCGTCATCGACCAAGTCATGAAG-3’(SEQ ID NO.18)。

R1：5’-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGG-3’(SEQ ID NO.19)；

LB-test：5’-AAGACGTCCGGGGGAACCGTTGTTC-3’(SEQ ID NO.20)；

本发明所述PCR反应体系为：

PCR反应条件为：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

本发明提供用于检测转化事件“双抗12-15”的引物对，所述引物对由特异性识别T-DNA插入序列的第一引物和任意特异性识别SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物序列为：LB-15T或RB-15T，所述第二引物序列为：LB-15G或RB-15G。

本发明提供一种鉴定玉米转化事件“双抗12-15”的方法，其包括：

4)从待鉴定的玉米样品提取基因组DNA；

5)以提取的DNA样品为模板，使用本发明提供的引物对进行PCR扩增；

6)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与转化事件上所述PCR引物对的序列之间的理论

长度一致，则说明所述样品中含有“双抗12-15”。

本发明还提供一种玉米转化事件“双抗12-15”特异性的PCR鉴定方法，所述用于玉米转化事件“双抗12-15”特异性PCR鉴定的引物(RB-15T和RB-15G是检测外源基因右侧是否与玉米基因组特异性位点连接，LB-15T和LB-15G是检测外源基因左侧是否与玉米基因组特异性位点连接)为：

LB-15T：5’-CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC-3’(SEQ ID NO.21)；

LB-15G：5’-GCCGTACGTTTCCCAGCC-3’(SEQ ID NO.22)。

RB-15T：5’-AGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGT-3’(SEQ ID NO.23)；

RB-15G：5’-CGTACAGGGAGCTTAGGGGG-3’(SEQ ID NO.24)；

本发明所述PCR反应体系为：

PCR反应条件为：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。

本发明提供一种所述玉米转化事件在制备抗虫抗草甘膦玉米细胞中的应用，利用含有所述玉米转化事件的玉米材料与玉米育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得所述抗虫抗草甘膦玉米细胞。具体利用抗虫抗草甘膦转化事件“双抗12-5”培育抗虫抗草甘膦玉米的方法，包括：利用含有转化事件“双抗12-5”的玉米材料与其它玉米育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明所述转化事件“双抗12-5”的新材料。

本发明提供利用抗虫抗草甘膦转化事件“双抗12-15”培育抗虫抗草甘膦玉米的方法，包括：利用含有转化事件“双抗12-15”的玉米材料与其它玉米育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明所述转化事件“双抗12-15”的新材料。

本发明所述含“双抗12-5”转化事件(即SEQ ID NO.12)的植物细胞，即玉蜀黍属玉米Zeamays L.双抗12-5种子，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：P201506，保藏日期：2015年4月27日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。

本发明所述含“双抗12-15”转化事件(即SEQ ID NO.16)的植物细胞，即玉蜀黍属玉米Zeamays L.双抗12-15种子，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:P201607，保藏日期：2016年4月11日，保藏地址：中国武汉武汉大学，邮编430072。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了优良的转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”，所述转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有抗虫抗草甘膦的能力；抗虫抗草甘膦基因在受体玉米中能够稳定遗传；抗虫抗草甘膦基因的表达对受体玉米的农艺性状不会产生不良影响。

(四)附图说明

图1、实施例1含目的基因的质粒结构图，LB和RB：T-DNA的边界序列；pZmUbi-1：玉米polyubiqutin-1启动子；p35S：35S启动子(CaMV病毒)；G10evo：抗草甘膦EPSPS基因；Cry1Ab-Cry2Aj：抗虫Bt融合基因cry1Ab/cry2Aj。

图2、双抗12-5抗草甘膦基因的Southern杂交后的荧光显影图；BamHI为基因组经BamHI单酶切；XbaI为基因组经XbaI单酶切；以地高辛标记的G10evo全长DNA作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影；图右侧为DNA长度标准(bp)标记，箭头指杂交产生的特异性条带。

图3、双抗12-5抗虫基因的Southern杂交后荧光显影图；KpnI为双抗12-5的基因组DNA经过KpnI酶切；SmaI为“双抗12-5”的基因组DNA经过SmaI酶切，地高辛标记的Cry1Ab全长DNA作为探针，杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影，图右侧为DNA长度标准(bp)。

图4、双抗12-15抗虫基因的Southern杂交后的荧光显影图；SacI为基因组经SacI单酶切,AclI位双抗12-15基因组经AclI单酶切，M为DNA长度标准(bp).

图5、双抗12-15抗草甘膦基因的Southern杂交后的荧光显影图；BamHI为双抗12-15基因组经BamHI单酶切；XbaI为双抗12-15基因组经XbaI单酶切；以地高辛标记的G10evo全长DNA作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影；M为DNA长度标准(bp)标记。

图6、插入位点的PCR验证电泳图；1为转基因玉米双抗12-5左侧翼PCR；2为非转基因对照左侧翼PCR；3为转基因玉米右侧翼PCR；4为非转基因对照右侧翼PCR；M为DNA大小标准(PCR产物在200-500bp之间)。

图7、插入位点的PCR验证电泳图；玉米“双抗12-15”左侧翼PCR；1和2为非转基因对照；泳道3-6为转基因玉米“双抗12-15”；M为DNA大小标准(PCR产物在1170bp左右)。

图8、插入位点的PCR验证电泳图；玉米“双抗12-15”右侧翼PCR；1和2为非转基因对照；泳道3-6为转基因玉米“双抗12-15”；M为DNA大小标准(PCR产物在600bp左右)。

图9、双抗12-5在受体玉米中的DNA遗传稳定性检测电泳图；M为DNA大小标准样品(100bp梯度)；-为阴性对照(非转基因玉米)；+为阳性对照(加入了经过序列测定验证的PCR阳性产物的非转基因玉米样品)；1，2，3，4，5，6，7分别是第1，2，3，4，5，6，7代的受体玉米样品；PCR产物的预期大小是145bp，与PCR产物电泳分析的大小基本一致。

图10、“双抗12-15”在受体玉米中的DNA遗传稳定性检测电泳图；M为DNA大小标准样品(100bp梯度)；-为阴性对照(非转基因玉米)；+为阳性对照(加入了经过序列测定验证的PCR阳性产物的非转基因玉米样品)；1，2，3，4，5，6，7分别是第1，2，3，4，5，6，7代的受体玉米样品；PCR产物的预期大小是1000bp，与PCR产物电泳分析的大小基本一致。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：转化事件的获得

(1)含有外源基因的质粒载体的获得

本发明用于玉米转化的载体图谱如图1所示，转化质粒载体核苷酸序列为SEQ ID NO.13，具体载体组成元件的名称、位置如表1所示。其中T-DNA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。SEQ ID NO:2包含完整的抗草甘膦表达框和抗虫表达框，具体由如下部分组成，抗草甘膦表达框：来源于CaMV的35S启动子与玉米Polyubiqutin-1启动子形成的复合启动子(核苷酸序列为SEQ IDNO.9所示)，该复合启动子驱动5’端连有一段编码AHAS基因叶绿体信号肽的抗草甘膦基因G10evo(EPSPS)(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)，终止子是CaMV的35S基因终止子(长度为0.2kb，其核苷酸序列为SEQ ID NO.11)。抗虫表达框：Cry1Ab-PGKGGG-Cry2Aj融合基因，驱动Cry1Ab-Cry2Aj融合基因的启动子为来源于玉米polyubiquitin-1基因启动子(pZmUbi-1)(通过PCR从玉米基因组获得，大小为2.1kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.7，pZmUbi-1可驱动目的基因在所有植物组织中表达)，终止子为来源于玉米的PEP carboxylase基因(pepc)终止子(大小为0.2kb，核苷酸序列为SEQ ID NO.8)。利用电击法(2500V)将获得的植物转化质粒导入农杆菌LBA4404中，获得含有植物转化载体的农杆菌。

表1玉米转化载体组成元件的名称、位置和功能

(2)玉米遗传转化

本研究中获得玉米转化事件所用的方法是农杆菌介导方法，根据Frame等报道的方法和培养基配方(Plant Physiol,2002,129:13-22)进行转化，使用草甘膦为筛选试剂，具体步骤如下：

(1)取授粉后8～10天的亲本玉米穗，收集大小为1.0-1.5mm未成熟胚。将含有转化载体的农杆菌与未成熟胚在22℃共培养2-3天。

(2)将步骤(1)培养后的未成熟胚转移到含有终浓度200mg/L特美汀抗生素(葛兰素史克，美国)的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-14天杀灭农杆菌。

(3)将步骤(2)诱导培养后的所有愈伤组织转到含有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。

(4)转移步骤(3)所有的愈伤组织到新鲜的含有(2mM)草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。

(5)然后，转移步骤(4)成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。

(6)转移步骤(5)胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。

(7)转移步骤(6)所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中生长繁种，用于筛选分析。

实施例2：转化事件的筛选

通过农杆菌介导获得了240个抗虫抗草甘膦玉米独立转化体(实施例1)。根据载体序列(SEQID NO.13设计引物，用PCR方法筛选含有抗草甘膦基因G10eve(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)和抗虫基因cry1Ab-cry2Aj(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)，同时不含载体骨架序列的玉米转化体，并在温室中进行抗虫抗草甘膦性能的初步测试：通过喷施0.4wt％的草甘膦，去除草甘膦抗性差的转化体，在剩余的转化体上接玉米螟，筛选没有玉米螟为害的转化体，共计获得15个含转化事件编号为“双抗12-1”～“双抗12-15”的具有较强抗虫抗草甘膦能力的玉米转化体。分别将含双抗独立转化事件的转化体与玉米自交系B73杂交留种，进行随后的筛选分析。

(1)草甘膦抗性筛选

选择15个含转化事件“双抗12-1”-转化事件“双抗12-15”的转化体的T3和T5代转基因玉米进行草甘膦抗性对比。转基因玉米和亲本非转基因对照种子发芽后20-30天，长至4-5叶期，喷施终浓度为0.4wt％的草甘膦(农达，孟山都公司，美国)，使用量为25L/亩，7天后记录玉米生长发育情况和死亡率。草甘膦喷施试验结果如表2所示，转基因品系都具有明显的抗草甘膦能力。其中含有转化事件“双抗12-1”、“双抗12-3”、“双抗12-4”、“双抗12-5”、“双抗12-7”、“双抗12-9”、“双抗12-10”、“双抗12-12”、“双抗12-13”、“双抗12-14”和“双抗12-15”的草甘膦抗性水平比较高。

表2.双抗玉米草甘膦抗性试验

(2)抗虫能力测试

1)田间抗虫能力测试

分别选择15个含转化事件“双抗12-1”～“双抗12-15”的转化体的T3和T5代转基因玉米进行抗虫性能分析。转基因玉米和亲本非转基因对照温室中发芽后20天喷洒终浓度为0.4wt％的草甘膦确定是转基因后，各取10株，每株接1龄亚洲玉米螟10个，亚洲玉米螟来自中国农业科学院植物保护研究所玉米害虫组。将卵块至于28±1℃，RH 70±5％，16h:8h(L:D)条件下孵化，选取孵化12小时内的幼虫供生测实验用。接虫6天后调查玉米螟为害情况，进行抗虫分级。抗虫分级采用9级标准(Marcon et al.,1999)：1～3级：虫孔针刺状(1级：稀少、分散；2级：中等数量；3级：大量)。4～6级：虫孔火柴头大小(4级：稀少、分散；5级：中等数量；6级：大量)。7～9级：虫孔大于火柴头(7级：稀少分散；8级：中等数量；9级：大量)。抗性级别分类：1～2级(高抗)，3～4级(抗虫)，5～6级(感虫)，7～9级(高感)。结果如表3所示，“双抗12-1”、“双抗12-5”、“双抗12-9”、“双抗12-10”、“双抗12-11”、“双抗12-13”、“双抗12-14”和“双抗12-15”具有高抗虫性能。

表3：不同转化事件对玉米螟的抗性等级鉴定

2)实验室抗虫性能测试

分别选择15个含转化事件“双抗12-1”～“双抗12-15”的转化体的T3和T5代转基因玉米，在转基因玉米和对照玉米心叶中期(6-8叶完全展开)选择未完全展开的心叶叶片在实验室进行玉米螟抗性测定。接玉米螟2天后调查取食面积和玉米螟死亡情况。结果见表4所示，结果显示大部分转基因玉米抗性良好。它们的叶片被取食非常少，特别是双抗12-5、双抗12-9、双抗12-11、双抗12-14和双抗12-15接虫2天后玉米螟取食面积不到10mm²。接虫2天以后玉米螟死亡率在80％以上，4天以后大部分转基因玉米螟死亡率到达100％。

表4：转基因玉米心叶期对亚洲玉米螟的抗虫性

注：表4中a、b表示差异显著

(3)外源基因插入拷贝数鉴定

综合抗虫和抗草甘膦测定结果，选择抗虫和耐草甘膦能力都比较强的双抗12-1、双抗12-5、双抗12-9、双抗12-10、双抗12-14和双抗12-15进行外源基因插入拷贝数鉴定。使用罗氏公司(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II，Roche)进行Southern分析，遵照试剂盒提供的操作步骤进行杂交探针制作和DNA杂交检测。即提取玉米基因组DNA，分别经过限制性内切酶BamHI和XbaI酶切(这些限制性内切酶在外源基因中具有单个的识别位点)，在琼脂糖胶上电泳分离酶切片段，然后将DNA转移到尼龙基质膜上，利用地高辛标记的G10eve(核苷酸序列SEQ ID NO.5)全长DNA作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影。结果显示转化事件“双抗12-5”在BamHI酶切时获得一条大约14kb的信号带，利用XbaI酶切时获得大约5.0kb的信号带(图2)，证明“双抗12-5”中抗草甘膦基因是单拷贝插入。转化事件“双抗12-15”在BamHI酶切时获得一条大约2.5kb的信号带，而在XbaI酶切时获得大约8.7kb的信号带(图5)，证明“双抗12-15”中抗草甘膦基因是单拷贝插入。

利用T-DNA中右边的抗虫融合基因的Cry1Ab作为探针对“双抗12-5”抗虫基因拷贝数进行Southern杂交分析，分别用限制性内切酶KpnI和SmaI对“双抗12-5”的基因组DNA进行单酶切，在琼脂糖胶上分离以后，转移到尼龙基质膜上，然后利用地高辛标记的Cry1Ab(核苷酸序列SEQ ID NO.4中1-1947bp)作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影。结果显示，用KpnI酶切时获得一条大约7kb的信号带，而在SmaI酶切时获得大约6.5kb的信号带(图3)。

分别用限制性内切酶SacI和AclI对转化事件“双抗12-15”的基因组DNA进行单酶切，在琼脂糖胶上分离以后，转移到尼龙基质膜上，然后利用地高辛标记的Cry1Ab(核苷酸序列SEQ ID NO.4中1-1947bp)作为探针杂交到尼龙基质膜上以后荧光显影。结果显示，SacI酶切时获得一条大约7.8kb的信号带，而用AclI酶切时获得大约5.0kb的信号带(图4)。

因此上述实验证明转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”是一个抗虫基因和抗草甘膦基因都是单拷贝插入的转化事件。

(4)转基因玉米的农艺性状

根据抗虫性能、抗草甘膦能力和外源基因插入拷贝数，筛选获得具有高抗虫抗草甘膦能力，外源基因单拷贝插入的“双抗12-5”和“双抗12-15”进行农艺性状分析。结果显示转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”生长期、花期与非转基因亲本没有差异，在转基因玉米上使用草甘膦除草对“双抗12-5”和“双抗12-15”的产量没有影响(表5)。

表5：转基因玉米的每穗粒数、100粒重量和生育期

注：*表示由于严重的虫害造成粒重和粒数降低。

实施例3：外源基因插入位点侧翼序列的鉴定

使用Liu等报道的TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)方法(Liu，Plant Journal1995，8(3):457-463)对优良转化事件“双抗12-5”和“双抗12-15”外源转基因DNA插入点两侧的区域序列进行测定。该方法通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR扩增，利用不同退火温度选择性地扩增目标片段。对扩增获得的DNA片段进行克隆、测序并与网上玉米基因组数据库(http://www.maizegdb.org)进行比对分析。

对转化事件“双抗12-5”T-DNA左侧翼区的DNA片段进行测序和比对，获得的序列为SEQ ID NO.1，其中核苷酸1-576bp之间的序列对应于玉米基因组DNA，核苷酸577-826bp之间的序列对应于外源DNA。对T-DNA右侧翼区的DNA片段进行测序和比对，获得的序列为SEQ ID NO.3，其中，核苷酸1-210bp的序列对应于外源DNA，核苷酸211-1007bp的序列对应于玉米基因组DNA。将上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列和外源T-DNA序列整合形成本发明所述的转化事件“双抗12-5”的特异性核苷酸序列，序列编号为SEQ ID NO.12(即SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的拼接而成)。

对转化事件“双抗12-15”T-DNA左侧翼区的DNA片段进行测序和比对，获得的序列为SEQID NO.14，其中核苷酸1-1064bp之间的序列对应于玉米基因组DNA，核苷酸1065-1172bp之间的序列对应于外源DNA。对T-DNA右侧翼区的DNA片段进行测序和比对，获得的序列为SEQ ID NO.15，其中，核苷酸1-54bp的序列对应于外源DNA，核苷酸55-604bp的序列对应于玉米基因组DNA。将上述经测序比对和验证过的插入位点上下游旁侧序列外源T-DNA序列整合形成本发明所述的转化事件“双抗12-15”的特异性核苷酸序列，序列编号为SEQ ID NO.16(即SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.15的拼接而成)。

(2)外源基因特异性检测

根据转化事件的核苷酸序列(SEQ ID NO.12)设计可以用于特异性检测“双抗12-5”的PCR引物(如表6所示)。

表6.“双抗12-5”特异性检测引物

所述PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因组DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加双蒸水至50μL。

PCR条件是：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的条件可以根据使用的酶和反应体系进行调整。对获得PCR产物进行琼脂糖电泳分析。左右边界的特异PCR产物分别是304bp和350bp(图6)。必要的时候也可以对PCR产物进行序列测定进一步验证。

根据转化事件的核苷酸序列(SEQ ID NO.16)设计可以用于特异性检测双抗12-15的PCR引物(如表7所示)。

表7.双抗12-15特异性检测引物

所述PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μL，dNTP混合物200μmol/L，正向引物10pmol，反向引物10pmol，基因组DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加双蒸水至50μL。

PCR条件是：32个循环，每个循环是95℃，45秒；65℃，50秒；72℃，30秒。PCR的条件可以根据使用的酶和反应体系进行调整。对获得PCR产物进行琼脂糖电泳分析。左右边界的特异PCR产物分别是1171bp(图7)和604bp(图8)。必要的时候也可以将PCR产物进行序列测定进一步验证。

实施例4：遗传稳定性检测

1)转化事件“双抗12-5”在受体玉米中的遗传稳定性检测

根据转化事件“双抗12-5”的重组DNA分子(SEQ ID NO.12)设计引物进行插入位点特异性的PCR检测，分别取1-7代次的受体玉米提取基因组，利用PCR鉴定T-DNA整合情况。引物为：BR-1(5’GGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCT-3’)(SEQ ID NO.25)和GN-1(5’CCTACTGCGATGACGTTCGGTGCC-3’)(SEQ ID NO.26)，

反应体系：10×扩增缓冲液5μL，dNTP混合物200μmol/L，BR-110pmol，10pmolGN-1，基因组DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加双蒸水至50μL。

反应条件：95℃1分钟，60℃40秒，72℃30秒，30个循环。TAQ酶从上海生工获得。结果显示，所有代次的转基因玉米PCR结果都为阳性。琼脂糖电泳分析显示，PCR产物大小与预期大小一致是145bp(图9)。

“双抗12-5”抗虫抗草甘膦生物测定

玉米螟生物测定(Marcon et al.,1999)表明第1,2,3,4,5,6,7代的转基因玉米对一龄玉米螟的杀虫效果都是100％，抗虫能力稳定遗传。喷施草甘膦试验表明，第1,2,3,4,5,6,7代的转基因玉米都能抗每亩100克活性草甘膦含量的草甘膦农药。抗草甘膦能力稳定遗传。结果证明抗虫和抗草甘膦能力稳定遗传。

2)转化事件“双抗12-15”在受体玉米中的遗传稳定性检测

根据转化事件“双抗12-15”的重组DNA分子(SEQ ID NO.16)设计引物进行插入位点特异性的PCR检测，分别取1-7代次的受体玉米提取基因组，利用PCR鉴定T-DNA整合情况。引物为：LB-SP4：5’CTAAAACCAAAATCCAGTACTAAAATCC(SEQ ID NO.27)和LB-M:CTGTTCTGATGGTGGCAGGCAGG(SEQ ID NO.28)，

反应体系：10×扩增缓冲液5μL，dNTP混合物200μmol/L，BR-110pmol，10pmolGN-1，基因组DNA0.1～2μg，Taq DNA聚合酶2.5μL，MgCl₂1.5mmol/L，加双蒸水至50μL。

反应条件：95℃1分钟，60℃40秒，72℃30秒，30个循环。TAQ酶从上海生工获得。结果显示，所有代次的转基因玉米PCR结果都为阳性。琼脂糖电泳分析显示，PCR产物大小与预期大小一致是1000bp(图10)。

“双抗12-15”抗虫抗草甘膦生物测定

玉米螟生物测定表明第1,2,3,4,5代的转基因玉米对一龄玉米螟的杀虫效果都是100％，抗虫性能稳定遗传。喷施草甘膦试验表明，第1,2,3,4,5代的转基因玉米都能抗每亩100克活性草甘膦含量的草甘膦农药。抗草甘膦性能稳定遗传。结果证明抗虫和抗草甘膦能力稳定遗传。

实施例5：抗虫抗草甘膦玉米品种培育

1)“双抗12-5”杂交转育

以含有“双抗12-5”转化事件的玉米为供体亲本，以玉米自交系B73为受体亲本进行一次杂交，4次回交和3次自交。在回交过程中使用草甘膦来清除不含“双抗12-5”转基因复合结构的分离株系。于BC4F3代(回交4代后自交3代)获得了含有本发明所述的复合转基因结构的稳定自交系B735。从该株系叶片组织中提取DNA，扩增出外源插入基因及其侧翼的DNA片断，经测序分析证实，来自与供体亲本的复合转基因结构序列一致，说明“双抗12-5”转化事件稳定转育到新的受体材料中。以B735为母本，Mo17为父本组配获得杂交种B7M，对B7M进行外源插入基因及其侧翼DNA的PCR分析和测序，结果显示B7M含有转化事件“双抗12-5”。田间抗性试验显示，B7M具有良好的抗草甘膦能力和抗虫性能。

1)“双抗12-15”有性杂交转育

以含有“双抗12-15”转化事件的玉米为供体亲本，以玉米自交系MR-1为受体亲本进行一次杂交，4次回交和3次自交。在回交过程中使用草甘膦来清除不含“双抗12-15”转基因复合结构的分离株系。于BC4F3代(回交4代后自交3代)获得了含有本发明所述的复合转基因结构的稳定自交系M45。从该株系叶片组织中提取DNA，扩增出外源插入基因及其侧翼的DNA片断，经测序分析证实，来自与供体亲本的复合转基因结构序列一致，说明“双抗12-15”转化事件稳定转育到新的受体材料中。以M45为母本，RF1为父本组配获得杂交种M7R，对M7R进行外源插入基因及其侧翼DNA的PCR分析和测序，结果显示M7R含有转化事件“双抗12-15”。田间抗性试验显示，M7R具有良好的抗草甘膦能力和抗虫性能。