技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法。
背景技术：
乳腺上皮细胞是乳腺中唯一具有分泌功能的细胞，是实现泌乳的基础，同时也是构成乳腺先天免疫屏障的重要组成部分，原代细胞无论是形态结构还是生理生化特性方面，都能很好的反映体内的真实情况，适合于生理、病理、药理等方面的研究，乳腺上皮细胞已用于研究泌乳机制、乳房炎发病机制以及药物筛选等，故该细胞成为研究泌乳机制、乳房炎发病机制和药物筛选的重要工具。随着组织培养技术的广泛应用，奶牛乳腺上皮细胞体外培养技术也得到了迅速发展和应用，该技术能够避免体内试验周期长、成本高、条件复杂、且存在个体差异等诸多问题，所以在体外培养时获得细胞状态良好、增殖能力强的奶牛乳腺上皮细胞是众多研究人员的目标。目前奶牛乳腺上皮细胞原代培养主要有四种方法，分别为组织块培养法、机械破碎法、酶消化法以及乳汁分离法。但这些方法均存在一些缺陷。组织块培养法优点是成本低、操作简单、获得的细胞生长增殖能力较强；但是缺点是耗时长，后续纯化工作难度大。机械破碎法的优点是操作简单、成本低、细胞得率较高且生长迅速；缺点是对细胞有一定机械损伤并且后续需要纯化。酶消化法的优势是细胞增殖较快且纯度较高；缺点是酶对细胞会造成一定损伤，所以在操作过程中要严格控制酶的浓度和消化时间。乳汁提取法的优势在于得到的细胞纯度较高、活性好、所需时间短，但该方法依然存在一些问题，如需要正确把握采样时间、对奶的质量和数量要求较高、获得的细胞数量较少、会有部分免疫细胞污染等。所以为了在体外成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞，本领域技术人员不仅在方法上需要进行改进，而且在组织的选择上和操作的细节方面也需要不断改进。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，不仅确定了奶牛乳腺上皮细胞原代培养的乳腺组织部位选择，而且对原有体外培养方法进行了改进。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，是将奶牛乳腺组织预处理后采用培养瓶侧置法静置贴壁培养30min，再配合组织块回收法进行分离培养，最后采用差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。
进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述奶牛乳腺组织为已达到性成熟、无泌乳史的奶牛的乳腺组织的中部。
进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述奶牛乳腺组织的预处理方法为：取奶牛乳腺中部组织置于75%的酒精中浸泡3min，用无菌生理盐水浸洗3～4次去除酒精；无菌操作剔除乳腺组织外部泛白的组织、脂肪组织和结缔组织，即得到乳腺上皮细胞的实质组织，然后用D-Hank′s液冲洗3～4次后放入装有适量D-Hank′s液的烧杯中，将实质组织剪成1mm3的小块；用D-Hank′s液将剪碎的小块实质组织清洗干净，弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5mL枪头吸取组织块糊状物；将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布，采用培养瓶侧置法静置贴壁培养30min。
进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述组织块回收法的操作过程为：取出上述的侧置法静置贴壁培养30min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入完全培养液，覆没组织块，放入二氧化碳培养箱中37℃、5%CO2培养，培养液变黄时及时更换新鲜培养液；待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。
进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述完全培养液的制备方法为：在DMEM/F12基础培养液中按体积比5:1的比例加入胎牛血清FBS，然后加入抑菌药物，其中青霉素的含量为500U/mL，链霉素的含量为500U/mL，两性霉素B的含量为5μg/mL。
进一步的，上述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，所述差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化奶牛乳腺上皮细胞的具体操作过程为：差时胰酶消化法，将上述得到的细胞弃去培养液，经D-Hank’s清洗后，加入1mL胰酶消化液，消化30～60s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，待成纤维细胞收缩变圆浮起，乳腺上皮细胞已有收缩但未浮起时，立即加入2mL完全培养液终止消化，轻轻晃动后弃去完全培养液，加入4mLD-Hank’s液，轻轻洗除残余的成纤维细胞，加入完全培养液在细胞培养箱中37℃、5%CO2培养；瓶内消化法，是在差时胰酶消化法纯化奶牛乳腺上皮细胞的过程中，进行瓶内消化平铺：加入4mLD-Hank’s液，清洗后，加入1mL消化液，消化2～3.5min后，弃去600μL消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入4mL完全培养液终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞，利于培养。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，成功获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞，同时，使细胞爬出时间缩短，细胞增殖速度提高，细胞生长状态良好，大大降低了细胞污染的可能性，避免了采用泌乳期乳腺组织初乳不易清洗且容易污染的问题。
附图说明
图1为培养瓶摆放法示意图。
其中，A为侧置法，B为倒置法。
图2为采用组织块法后，不同部位组织细胞生长情况图。
其中，A1为上部组织第4天细胞生长情况，A2为上部组织第5天细胞生长情况，A3为上部组织第6天细胞生长情况；B1为中部组织第4天细胞生长情况，B2为中部组织第5天细胞生长情况，B3为上部组织第6天细胞生长情况；C1为下部组织第4天细胞生长情况，C2为上部组织第5天细胞生长情况，C3为上部组织第6天细胞生长情况。
图3为奶牛乳腺上皮细胞的纯化前后对比图。
其中，A为纯化前的细胞（1为脂肪颗粒，2为纯化前的bMEC，3为纯化前的纤维细胞）；B为纯化后的奶牛乳腺上皮细胞。
图4为奶牛乳腺上皮细胞的角蛋白18的鉴定结果图。
其中A为荧光标记的细胞角蛋白-18；B为细胞核染色；C为A图与B图的合并图。
具体实施方式
实施例1：
1、实验动物：
试验动物为24月龄健康育成荷斯坦奶牛，无泌乳史。
2、采集整体乳腺组织：
试验奶牛屠宰后，乳房表面用清水充分冲洗，75%酒精消毒，高压灭菌解剖刀剖离整个乳房，置于75%酒精处理过的采样箱中，1h内带回实验室。
3、细胞培养用乳腺组织处理“
再用75%酒精消毒组织表面，避开脂肪组织、结缔组织和血管，剪取组织内部的乳腺实质，约2.5cm3，组织剪取部位分别如下：
上部组织：组织呈黄色，质密，与周围脂肪组织界限明显，无导管。
中部组织：组织呈黄色，比较质密，有可见细小导管。
下部组织：组织呈黄色，比较松散，有较粗的导管组织，剪取贴近导管的乳腺实质组织。
采集的组织75%酒精浸泡3min后转移入细胞间。
4、乳腺上皮细胞组织块法分离培养：
预先在每个培养瓶内加入鼠尾胶原，覆盖整个瓶底，紫外灯下照射4h，接种之前倒掉胶原，清洗3次；在无菌操作台中将处理的组织块从75%的酒精中取出，用无菌生理盐水浸洗3～4次以去除酒精；无菌操作剔除上述乳腺组织外部泛白的组织、脂肪组织和结缔组织，即得到乳腺上皮细胞的实质组织，然后用D-Hank’s液冲洗3～4次后放入装有适量D-Hank’s液的小烧杯，将实质组织剪成约1mm3的小块；用D-Hank’s液将剪碎的小块实质组织清洗干净，弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5mL枪头吸取组织块糊状物，以不阻塞枪头为宜；将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布，如图1所示，分别采用培养瓶侧置法和倒置法2种方法，静置时间采用30min和1h2个时间；取出培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口慢慢加入完全培养液，恰好覆没组织块为佳，放入培养箱中培养，培养液变黄时要及时更换新鲜的培养液；待细胞几乎铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时换液。上部组织、中部组织、下部组织分别按照以上方法进行细胞培养，并做好标记，显微镜下跟踪观察。结果，相同时间内培养瓶侧置法组织贴壁效果优于倒置法，静置30min即贴壁效果最佳。侧置处理的组织块培养至第4～5天可见细胞爬出，倒置处理的组织块培养至第6天可见细胞爬出；鹅卵石样乳腺上皮细胞后于成纤维细胞爬出，两者间有明显界限；部分组织可直接爬出鹅卵石样上皮细胞，无成纤维细胞爬出。回收的组织接种后第2天即有细胞爬出，且鹅卵石样细胞比例较高。组织块法观察结果显示，上部组织不易爬出细胞，且细胞增殖速度较慢（如图2中A1-A3）；中部组织容易直接爬出，且细胞生长速度较快（如图2中B1-B3）；下部组织最先长出细胞且细胞生长速度快，但大部分为成纤维细胞，后期长出乳腺上皮细胞，与成纤维细胞接触部位有较为明显的分界线（如图2中C1-C3）。
5、采用差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化获得奶牛乳腺上皮细胞：
差时胰酶消化法：细胞弃去培养液，经D-Hank’s清洗后，加入1mL胰酶消化液，约30～60s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，成纤维细胞收缩变圆浮起，乳腺上皮细胞略收缩，未浮起，立即加入2mL完全培养液终止消化，并弃去完全培养液，加入4mLD-Hank’s液，轻轻洗除残余的成纤维细胞，加入完全培养液在细胞培养箱（37，5%CO2）中培养。每日在显微镜下观察细胞，如细胞密度不大，且看到细胞中仍残留部分成纤维细胞，则重复差时胰酶消化法，纯化2～3次即可得到较纯的奶牛乳腺上皮细胞。
瓶内消化法：在差时胰酶消化法纯化的过程中，如果显微镜下观察细胞，如果发现乳腺上皮细胞呈片聚集生长，不利于细胞增殖，可进行瓶内消化平铺：加入4mLD-Hank’s液，清洗后，加入1mL消化液，消化约2～3.5min后，弃去约600μL消化液，然后从底部拍打平底，使细胞完全脱落，加入4mL完全培养液，终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞，培养。
采用差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化，最终获得纯化的、生长状态良好的奶牛乳腺上皮细胞（图3）。
6、奶牛乳腺上皮细胞鉴定：
盖玻片的处理：取盖玻片清洗后经酸处理48h，充分冲洗干净，然后浸泡于无水乙醇中。在6孔细胞培养板底部滴一滴培养液，夹取盖玻片，待酒精挥发后轻轻放入6孔细胞培养板；将细胞调整至适当浓度接种于6孔板中，等细胞单层融合到80%的时候除去培养液，然后用D-Hank’s溶液洗细胞2次，每次5min；用预冷的4%多聚甲醛固定细胞，4℃下10min，去除多聚甲醛，用TBSTx溶液清洗细胞，放在摇床上轻轻摇动，每次5min，重复3次，最后滤纸擦净边缘水分；用含有5%BSA的TBSTx封闭液浸没细胞爬片，37℃封闭1h；去除封闭液，将角蛋白18的一抗用含有5%BSA的TBSTx稀释50倍，滴加在细胞爬片上，37℃孵育1h；小心吸除一抗，用TBSTx将细胞洗3次，摇床上缓慢摇动，每次5min；细胞浸于含有5%BSA的TBSTx稀释100倍后的FITC标记的二抗，37℃孵育60min；小心吸除二抗，用TBSTx清洗细胞3次，摇床上缓慢摇动，每次5min；将1μg/mlPI染色液滴加到细胞爬片上，室温下孵育15min；吸去PI染色液，用TBSTx清洗细胞3次，摇床上缓慢摇动，每次5min；取洁净载玻片，中央滴加1-2滴荧光淬灭剂，取出细胞爬片，将长有细胞的一侧向下，进行封片在荧光显微镜下观察。如图4所示，结果表明，乳腺上皮细胞特异性表达角蛋白18，且其细胞核位置与细胞核染色位置基本重合，成功获得了纯化的奶牛乳腺上皮细胞。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。