本发明涉及一种利用毕赤酵母高效分泌表达转肽酶SortaseA的方法，属于基因工程领域。
背景技术：
SortaseA是一类介导革兰氏阳性菌细胞壁锚定蛋白与细胞壁共价结合的转肽酶，近些年其在生物技术领域的应用吸引了越来越多的关注。自从2004年首次报道应用SortaseA作为一种蛋白质或多肽的连接工具以来，SortaseA参与的连接反应迅速成为一个研究热点，已被广泛应用于生物化学、蛋白质组学、生物医药以及生物工程技术等领域。但到目前为止，关于SortaseA高效表达和工业化生产的研究却很少，酶的表达方式仍主要局限于大肠杆菌的胞内表达。SortaseA的胞内表达存在以下几个主要的缺陷：(1)产率较低：在已有的报道中，最高产率仅为76.9mg/L；(2)胞内表达的SortaseA易在菌体内形成包涵体，且纯化前还需要经过耗时且成本较高的细胞破碎步骤；(3)SortaseA的表达载体是游离型的质粒，易于丢失，会导致生产菌株的发酵特性不稳定容易退化。因此，急需实现SortaseA的高效分泌表达，以满足未来在蛋白质工程、酶工程中对SortaseA日益增长的需求。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题首先是提供一种高效分泌表达转肽酶SortaseA的重组毕赤酵母，用于实现SortaseA的高效分泌表达。
所述重组毕赤酵母是以pPIC9k(含α信号肽)为表达载体，选择AOX1或GAP启动子，以毕赤酵母GS115、SMD1168或KM71为表达宿主，构建得到分泌表达SortaseA的基因工程菌株。
在本发明的一种实施方式中，以AOX1为启动子。
在本发明的一种实施方式中，以毕赤酵母SMD1168为宿主。
在本发明的一种实施方式中，以AOX1为启动子、SMD1168为宿主，构建得到一株重组毕赤酵母。
本发明还提供了一种应用重组毕赤酵母生产转肽酶SortaseA的方法，是将重组毕赤酵母诱导培养使其表达转肽酶SortaseA。
在本发明的一种实施方式中，重组毕赤酵母在BMGY培养基中活化。所述BMGY培养基含13.4g/L不含氨基酸的YNB，20g/L蛋白胨，10g/L酵母膏，10g/L甘油，100mM磷酸盐。
在本发明的一种实施方式中，活化后的重组毕赤酵母转接至初始pH6.0的BSM无机培养基中，28℃诱导产酶，每隔24h加入1.5％含微量元素的纯甲醇进行诱导表达，诱导培养72h。所述BSM无机培养基含26.7ml/L磷酸，0.93g/L硫酸钙，18.2g/L硫酸钾，14.9g/L硫酸镁，4.13g/L氢氧化钾，40g/L甘油。所述含微量元素的纯甲醇是含CuSO4·5H2O6.0g/L，KI0.088g/L，MnSO4·H2O3.0g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.02g/L，CoCl2·6H2O0.5g/L，ZnCl220.0g/L，FeSO4·7H2O65.0g/L，Biotin0.2g/L，浓H2SO45.0mL/L的纯甲醇。
本发明以pPIC9k(含α信号肽)为表达载体，选择AOX1或GAP启动子，以毕赤酵母GS115、SMD1168或KM71为表达宿主，构建得到分泌表达SortaseA的基因工程菌株。该菌株的遗传具有稳定性，在合适的培养条件下SortaseA的胞外酶活和表达水平可以达到131.9U/mL和97.8mg/L。解决了目前已有报道中该酶在大肠杆菌胞内表达中存在的产率较低、菌体需要破壁和菌株不稳定的问题，为该酶的工业化生产及其在蛋白质工程领域的应用打下了基础。
附图说明
图1SMDAOX-3菌株10个单菌落基因组上srtA基因拷贝数荧光定量PCR检测结果
图2诱导时间、诱导温度、诱导初始pH值和甲醇浓度对SortaseA分泌表达的影响：(A)诱导时间+诱导温度；(B)诱导初始pH值；(C)甲醇浓度
具体实施方式
SortaseA纯化方法：发酵结束后的菌液于4℃，9000rpm离心10min后取上清，即为粗酶液。粗酶液中的SortaseA用HisTag标签蛋白螯合磁珠(海狸纳米科技有限公司)进行纯化，具体操作步骤参看磁珠使用说明。
蛋白含量的测定：使用碧云天生物技术研究所研发的Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行检测，具体操作步骤参看试剂盒使用说明。
SortaseA酶活测定方法：利用SortaseA能够切断肽段LPXTG序列中Thr和Gly之间肽键的原理，合成了特异性底物Dabcyl-QALPETGEE-Edans(d-QALPETGEE-e)(吉尔生化有限公司)，其中Edans(e)是荧光基团，而Dabcyl(d)是淬灭基团。当该底物未被SortaseA切断时，Edans(e)在激发状态下发生荧光共振能量转移，其发出的荧光被临近的Dabcyl(d)吸收并以热的形式散发，荧光被淬灭，无法检测到荧光。而当SortaseA将底物切割，Edans(e)与Dabcyl(d)分离后，淬灭不再发生，可检测到产物的荧光值。因此可通过Edans(e)荧光强度的变化来检测SortaseA的酶活性。检测方法是在200μL反应体系中(50mMTris-HCl，150mMNaCl，10mMCaCl2)加入4μLd-QALPETGEE-e底物(1.25g/L)和20μLSortaseA粗酶液。混合液于SynergyTMH4全功能酶标仪(BioTek)中37℃下振荡反应1h，在激发波长350nm、发射波长495nm下检测荧光强度的变化情况。单位体积SortaseA酶活计算公式如下：
其中A代表单位体积SortaseA酶活(U/mL)，I60为反应1h结束时的荧光强度值，I0为动力学反应开始时的荧光强度值，VS为SortaseA粗酶液样品总体积(mL)，VL为SortaseA粗酶液加样量(0.02mL)。
实施例1SortaseA分泌表达毕赤酵母菌株的构建
以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的基因组为模版，Δ59-srtA-F和Δ59-srtA-R(表1)为引物扩增得到去除N端信号肽的srtA基因(SEQIDNO.1)，和T载体连接转化至E.coliJM109，经测序验证正确之后，再亚克隆至质粒pPIC9k的EcoRI/NotI位点得到pPIC9k-Δ59-srtA质粒；以P.pastorisGS115的基因组为模版，GAP-F和GAP-R(表1)为引物扩增得到GAP启动子序列，和T载体连接转化至E.coliJM109，经测序验证正确之后，再亚克隆至质粒pPIC9k-Δ59-srtA的SacI/BamHI位点以替换AOX启动子，得到pPIC9kGAP-Δ59-srtA质粒。将所得pPIC9k-Δ59-srtA和pPIC9kGAP-Δ59-srtA质粒分别转化至毕赤酵母表达宿主GS115、SMD1168和KM71中，并涂布于G418MD平板上，筛选得到可以用于SortaseA分泌表达的基因工程菌株。
将构建所得基因工程菌株在BMGY培养基(13.4g/L不含氨基酸的YNB培养基，20g/L蛋白胨，10g/L酵母膏,10g/L甘油，100mM磷酸盐)中活化后，按10％转接至BSM无机培养基中(26.7ml/L磷酸，0.93g/L硫酸钙，18.2g/L硫酸钾，14.9g/L硫酸镁，4.13g/L氢氧化钾，40g/L甘油)，30℃继续培养，每隔24h加入1％含微量元素(CuSO4·5H2O6.0g/L，KI0.088g/L，MnSO4·H2O3.0g/L，Na2MoO4·2H2O0.2g/L，H3BO30.02g/L，CoCl2·6H2O0.5g/L，ZnCl220.0g/L，FeSO4·7H2O65.0g/L，Biotin0.2g/L，浓H2SO45.0mL/L)的纯甲醇进行诱导表达。在诱导表达后的48h，取样收集上清用于后续胞外分泌SortaseA的检测。
实施例2毕赤酵母菌株胞外分泌SortaseA的检测
对实施例1获得的毕赤酵母基因工程菌株分泌至胞外的SortaseA分别进行了SDS-Page、胞外酶活和SortaseA浓度的检测表2)。结果表明，以AOX为启动子、SMD1168为宿主的菌株(命名为SMDAOX-3)所得胞外SortaseA的酶活(83.1U/mL)和浓度(56.3mg/L)最高，该菌还能在3.0g/LG418平板上生长。
实施例3SortaseA分泌表达最佳毕赤酵母菌株srtA基因整合拷贝数检测
为了确保所得SMDAOX-3菌株srtA基因整合表达的稳定性，对其基因组上srtA基因整合的拷贝数进行了检测。以毕赤酵母的ACT基因作为内参，采用相对定量PCR的方法利用特异性设计的引物(表1)对SMDAOX-3菌株重新涂布后随机挑选的10个单菌落进行了检测。检测结果(图1)表明10个菌落srtA基因整合的平均拷贝数为5.7，菌落之间的拷贝数差异不明显(p>0.05)。此平均拷贝数与SMDAOX-3菌株G418抗性的表型相符(每个整合至基因组的pPIC9k质粒能赋予宿主大约0.5g/L的G418抗性)，并说明SMDAOX-3菌株的遗传稳定性较好，适合较长周期的发酵生产。
实施例4发酵条件对SortaseA分泌表达的影响
本发明诱导温度、诱导时间、诱导pH和诱导甲醇浓度对SortaseA分泌表达的效率有影响，如图2A所示，诱导温度对SortaseA的胞外酶活水平有显著的影响，在28℃诱导时胞外酶活最高，胞外SortaseA酶活在诱导表达的72h达到最高值，在此之后胞外SortaseA酶活提高幅度很小(p>0.05)。因此，最佳诱导温度和诱导时间分别为28℃和72h。
至于诱导初始pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0)，虽然SMDAOX-3菌株可在较宽的pH范围内生长，但从图2B来看其最适合SortaseA分泌表达的诱导初始pH值是6.0。此外，重要的诱导剂甲醇的浓度(0.25％,0.5％,1.0％,1.5％,2.0％and2.5％)对于SortaseA的分泌表达量也起着至关重要的作用。图2C表明过高或过低的甲醇浓度对SortaseA的分泌表达均不利，当甲醇浓度为1.5％(v/v)时，最适合该酶的分泌表达。综合上述条件进行发酵，SortaseA的胞外酶活和表达水平可以分别提升至131.9U/mL和97.8mg/L。
表1实施例1和实施例3所用引物
注：加粗部分为限制性内切酶，划线部分为HisTag标签
表2毕赤酵母基因工程菌株胞外SortaseA酶活和浓度检测
注：“-”表示未检测到胞外的SortaseA活性或浓度