本发明涉及一种疫苗的制备方法，具体涉及一种禽流感H5N1的重组杆状病毒疫苗的制备方法。
背景技术：
：禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus)对禽类及人类的威胁日益加剧，禽流感的防制越来越重要。目前，禽流感的防治主要是疫苗免疫，然而，由于H5N1亚型高致病禽流感的血清型众多、易发生抗原的变异，传统疫苗不能提供有力的保护；核酸疫苗的应用存在免疫保护期不长，制备成本高，以及安全性等制约因素，未被广泛使用。杆状病毒由于具有在宿主细胞内不复制，安全性高，蛋白表达量高等优点被广泛应用于昆虫细胞及哺乳动物细胞的转导。在真核表达系统中，杆状病毒载体系统是目前研制亚单位苗的主要工具，它是以昆虫杆状病毒为外源基因载体的表达系统，形成的重组杆状病毒可直接作为禽类疫苗对家禽进行直接免疫，且重组杆状病毒疫苗兼有活疫苗和亚单位苗的特点。但是由于杆状病毒转导哺乳动物细胞的效率及基因表达水平偏低、外源基因持续表达的时间较短，限制了杆状病毒作为禽类疫苗的应用，因此，如何提高杆状病毒的转导效率、外源基因表达效率和延长外源基因的表达时间成为研究热点。血凝素HA作为禽流感病毒的主要保护性抗原，在其抗原性和致病性中发挥重要的作用。将H5N1型禽流感病毒HA基因克隆到由CMV启动的含有VSV-GED、WPRE、ITRs等调控元件的两组杆状病毒转移载体中，通过Bac-to-Bac系统获得重组BacmidDNA；通过对Sf9昆虫细胞的转染，收获重组杆状病毒；利用重组杆状病毒进一步侵染鸡胚成纤维细胞，检测HA基因在禽类细胞中的表达水平；将携带HA基因的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫试验，将目的抗原基因高效地传递到家禽细胞中，使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体和较强的细胞免疫应答；分析重组杆状病毒的表达时间及免疫效果，为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定基础。技术实现要素：为了克服上述问题，本发明一方面提供了一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCNO:V201606。本发明的另一方面提供了一种表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其中在病毒基因中插入包含禽流感病毒血凝素HA基因的基因片段，所述HA基因片段的核苷酸序列为SEQIDNO：1；优选还包含启动子CMV的核苷酸序列为SEQIDNO：2、调控元件VSV-GED的核苷酸序列为SEQIDNO：3、调控元件WPRE的核苷酸序列为SEQIDNO：4和/或调控元件ITRs的核苷酸序列为SEQIDNO：5。本发明再一方面还提供了一种重组H5N1病毒疫苗，其中包含根据权利要求1或2所述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株作为活性成分。本发明还提供了一种前述的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：1)pS-ITRs-HA质粒的构建，2)pS-ITRs-HA质粒转化E.coliDH10Bac，3)重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞，4)重组杆状病毒的扩增；其中步骤1)包括以下步骤：a)用PCR方法扩增鸡HA基因，并将鸡HA基因(核苷酸序列为SEQIDNO：1)连接至pMD18-T载体上得到pT-HA质粒；b)将VSV-GED片段(核苷酸序列为SEQIDNO：3)插入pFastBac1质粒中，获得pFB-V质粒；c)将gp64sp片段(核苷酸序列为SEQIDNO：8)插入pFB-V质粒中，获得pFB-GV质粒；d)将ITRs-L片段(核苷酸序列为SEQIDNO：6)插入pFB-GV质粒中，获得pFB-GV-ITRs-L质粒；e)将CMV片段(核苷酸序列为SEQIDNO：2)插入pFB-GV-ITRs-L质粒中，获得pFB-GV-ITRs-L-C质粒；f)将WPRE片段(核苷酸序列为SEQIDNO：4)插入pFB-GV-ITRs-L-C质粒中，获得pS-ITRs-L质粒；g)将ITRs-R片段(核苷酸序列为SEQIDNO：7)插入pS-ITRs-L质粒中，获得pS-ITRs质粒；h)将质粒pT-HA与质粒pS-ITRs进行连接，获得pS-ITRs-HA质粒。进一步地，所述制备方法，其中，步骤b)是指将VSV-GED片段与pFastBac1质粒以BamHI和HindIII进行双酶切，将具有相同粘性末端的VSV-GED片段和pFastBac1连接；步骤c)是指将gp64sp片段与pFB-V质粒进行BamHI和SalI双酶切，将具有相同粘性末端的gp64sp片段和pFB-V连接；步骤d)是指将ITRs-L片段与pFB-GV质粒分别进行SnaBI和Bsp14070双酶切，酶切反应后将带有粘性末端的ITRs-L和pFB-GV片段进行连接；步骤e)是指将CMV片段和pFB-GV-ITRs-L质粒进行限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，将酶切反应后带有相同粘性末端的CMV和pFB-GV-ITRs-L经行连接，步骤f)是指将pFB-GV-ITRs-L-C质粒与WPRE片段进行SalI和XhoI双酶切，将酶切反应后带有相同粘性末端的pFB-GV-ITRs-L-C和WPRE经行连接；步骤g)是指以限制性内切酶XhoI和RsrII对质粒pS-ITRs-L和ITRs-R片段进行酶切，将具有相同末端的pS-ITRs-L和ITRs-R连接；或步骤h)是指对质粒pT-HA与载体pS-ITRs进行SacII单酶切，将具有相同末端的pT-HA和pS-ITRs进行连接。进一步地，步骤2)为将质粒pS-ITRs-HA加入到E.coliDH10Bac感受态细胞中，进行蓝白筛选和抗生素筛选浓度(50μg/mLKan、7μg/mLGen、10μg/mLTet)；37℃培养至可见明显的蓝、白单菌落。挑取阳性白色菌落，震荡培养后提取重组杆状病毒穿梭质粒(Bacmid)。进一步地，步骤3)为取Sf9昆虫细胞，调整细胞密度至1-10×105个/mL，细胞贴壁培养1h后，在27℃培养细胞至72h，细胞50-99％出现感染迹象，收集P1代病毒。重组杆状病毒BV-S-ITRs-HA作为疫苗直接免疫鸡体后，用HA蛋白刺激免疫组的鸡外周血淋巴细胞，出现了明显的淋巴细胞增殖反应。对免疫鸡只的血清进行免疫检测，免疫鸡血清中IgG抗体的水平最高可达0.966，IL-2、IL-4和IFN-γ的浓度最高可分别达到89.67ng/L、80.21ng/L和64.24ng/L，以上结果表明重组杆状病毒疫苗可有效的刺激鸡体同时产生体液免疫和细胞免疫，为鸡群提供了双重免疫保护作用，本发明为基于杆状病毒的禽流感疫苗的研发奠定理论基础。本发明的表达禽流感病毒血凝素HA基因的重组H5N1病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCCNO:V201606，分类命名为禽流感病毒H5N1亚型BV-S-ITRs-HA，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学；保藏日期为2016年1月28日。附图说明附图1为HA基因的PCR结果，其中M为DNAMarkerDL2000；1为HA基因的PCR产物。附图2为片段CMV、WPRE的PCR结果，其中M为DNAMarkerDL2000；1为CMV基因的PCR产物；2为WPRE基因的PCR产物。附图3为片段VSVGED、gp64sp的PCR结果，其中1为VSVGED片段的PCR产物；2为gp64sp片段的PCR产物；M为DNAMarkerDL2000。附图4为片段ITR-L和ITR-R的PCR结果，其中1为片段ITR-L的PCR产物；2为片段ITR-R的PCR产物；M为DNAMarkerDL2000。具体实施方式实施例1.HA基因的克隆从鸡外周血中分离出淋巴细胞，培养8小时后，利用TrizolReagent试剂盒提取鸡淋巴细胞的基因组RNA，反转录得到cDNA第一链，PCR克隆出鸡HA基因，将其连接至pMD18-T载体上，经验证和测序正确后，命名为“pT-HA”。1.1鸡外周血淋巴细胞的培养用移液管将2mL淋巴细胞分离液加入15mL的离心管底，避免接触侧壁。抗凝血的针管取鸡翅膀腋下血3mL，加入3mLD-Hanks液，用移液管混匀，注意避免产生气泡，缓慢加入到淋巴细胞分离液上，2000r/min，离心20min后，用1mL注射器吸出白膜层，尽量少吸取分离液，置于15mL的离心管中。加入5mLD-Hanks液或是5mL不含血清的1640培养基，洗三次，1500r/min，离心10min。取出培养瓶培养，加入5mL1640培养基(含10μg/mLConA、10％小牛血清和1％双抗)，5％CO2培养箱37℃培养16h。1.2利用提取的RNA扩增HA基因的cDNA第一链利用TrizolReagent试剂盒提取鸡淋巴细胞的基因组RNA，具体实验方法见TrizolReagent试剂盒说明书。用紫外分光光度计测定提取的RNA浓度，A260/A280的值判断出是否有蛋白酶或DNA的污染，利用OligodT扩增cDNA第一链，反应体系如表1，反应程序如表2。表1扩增HA的cDNA第一链组分加入体积终浓度dNTPMixture(10mM)1μL1mmol/μLHA-downstreamprimer0.5μL0.5mmol/μL鸡淋巴细胞的总RNAxμL--RNaseinhibitor(40U/μL)0.5μL0.5mmol/μLRNasefreeH2OUpto10μL5.5-x注：实验样品RNA体积根据浓度确定，总量小于等于1μg。表2RT扩增HA的cDNA反应程序步骤时间温度循环数退火10min室温1延伸45min45℃1变性5min95℃1灭活5min冰浴11.3目的片段HA的克隆(1)以反转录获得的cDNA为模板，以HA-up和HA-down为引物(表3)，PCR扩增出HA基因，反应体系如表4，PCR反应程序设置如表5。表3引物序列表4PCR扩增HA反应体系表5PCR扩增HA基因反应程序PCR扩增结果如图1所示：PCR产物HA基因与目的片段大小相同，为1.7kb，与设计结果相符。实施例2.pT-HA质粒的构建条带检测正确后，将剩余的PCR产物进行回收纯化，具体操作步骤按照GelExtractionMiniKit说明书(天根，M2029)进行操作。对胶回收的HA片段进行加“A”处理，反应体系如表6，反应程序设置如表7。将处理后的回收产物与pMD18-T载体于16℃过夜连接，反应体系如表8。将验证正确的阳性质粒命名为“pT-HA”。表6PCR扩增产物HA末端加“A”反应体系表7PCR扩增产物HA加“A”反应程序表8HA片段与pMD18-T载体连接反应体系实施例3.pS-ITRs-HA质粒的构建pS-ITRs-HA质粒包含CMV启动子以及WPRE、VSV-GED、ITRs和gp64sp等调控元件，分别从模板质粒pEGFP-C3(购自Clontech公司)、pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(购自addgene公司)、pCMV-VSVG(购自addgene公司)、pAAV-LacZ(购自Agilent公)和Bacmid中将这些元件进行克隆及鉴定。3.1各元件克隆以质粒pEGFP-C3、pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE、pCMV-VSVG、pAAV-LacZ和Bacmid为模板，以CMV-up、CMV-down、WPRE-up、WPRE-down、VSV-GED-up、VSV-GED-down、ITRs-L-up、ITRs-L-down、ITRs-R-up、ITRs-R-down和gp64sp-up、gp64sp-down为上下游引物，PCR扩增CMV、WPRE、VSV-GED、ITRs和gp64sp等调控元件的基因，反应体系如表4、反应程序设置如表5。PCR扩增结果如图2、图3和图4所示：PCR产物CMV、WPRE、VSV-GED、gp64sp、ITR-L和ITR-R基因与目的片段大小相同，分别为610kb、650bp、210、114bp、200bp和203bp与设计结果相符。引物序列如表9。表9引物序列3.2pS-ITRs-HA质粒的构建3.2.1质粒pFB-V的构建将VSV-GED的PCR产物与质粒pFastBac1(购自Invitrogen公司)进行BamHI和HindIII双酶切，酶切体系如表10，将具有相同粘性末端的VSV-GED和pFastBac1片段连接，连接体系如表11，将验证正确的阳性质粒命名为“pFB-V”。表10酶切反应体系酶切反应体系组分体积10×KBuffer5μLDNA(pT-soe1/载体pFastBac1)10μL/5μLBamHI2.5μLHindIII2.5μLddH2OUpto50μL表11pFastBac1片段与GV载体连接反应体系连接反应体系组分体积10×ligationBuffer1μLpFastBac1(BamHI/HindIII)2μL(10ng)VSV-GED片段(BamHI/HindIII)0.5μL(5ng)T4DNALigase0.2μLddH2OUpto10μL3.2.2质粒pFB-GV的构建将gp64sp的PCR产物与质粒pFB-V进行BamHI和SalI双酶切，酶切体系如表10，将具有相同粘性末端的gp64sp和pFB-V片段连接，连接体系如表11，将验证正确的阳性质粒命名为“pFB-GV”。3.2.3质粒pFB-GV-ITRs-L的构建随后，将ITRs-L的PCR产物与质粒pFB-GV分别进行SnaBI和Bsp14070双酶切，酶切体系如表10，酶切反应后将带有粘性末端的ITRs-L和pFB-GV片段进行连接，连接反应体系如表11，将验证正确的阳性质粒命名为“pFB-GV-ITRs-L”。3.2.4质粒pFB-GV-ITRs-L-C的构建用限制性内切酶XbaI和EcoRI对CMV的PCR产物和质粒pFB-GV-ITRs-L进行双酶切，酶切体系如表10，将酶切反应后带有相同粘性末端的CMV和pFB-GV-ITRs-L经行连接，连接反应体系如表11，将验证正确的阳性质粒命名为“pFB-GV-ITRs-L-C”。3.2.5质粒pS-ITRs-L的构建将质粒pFB-GV-ITRs-L-C与WPRE的PCR产物经行SalI和XhoI双酶切酶切体系如表10，将酶切反应后带有相同粘性末端的pFB-GV-ITRs-L-C和WPRE经行连接，连接反应体系如表11，将验证正确的阳性质粒命名为“pS-ITRs-L”。3.2.6质粒pS-ITRs的构建用限制性内切酶XhoI和RsrII对质粒pS-ITRs-L和ITRs-R进行酶切，酶切反应体系如表10，将具有相同末端的pS-ITRs-L和ITRs-R连接，连接反应体系如表11，将验证正确的质粒命名为“pS-ITRs”。3.2.7质粒pS-ITRs-HA的构建对质粒pT-HA与质粒载体pS-ITRs进行SacII单酶切，反应体系如表10，将具有相同末端的pT-HA和pS-ITRs进行连接，连接反应体系如表11，将验证正确的阳性质粒命名为“pS-ITRs-HA”。实施例4.pS-ITRs-HA质粒转化E.coliDH10Bac将质粒pS-ITRs-HA加入到E.coliDH10Bac感受态细胞中，进行蓝白筛选和抗生素筛选浓度(50μg/mLKan、7μg/mLGen、10μg/mLTet)。37℃培养至可见明显的蓝、白单菌落。挑取阳性白色菌落，震荡培养后提取重组杆状病毒穿梭质粒(Bacmid)。实施例5.重组杆状病毒穿梭载体转染Sf9昆虫细胞取生长状态良好的Sf9昆虫细胞，调整细胞密度至5×105个/mL，按每孔2mL加入到六孔板中，细胞贴壁培养1h后，即可进行转染实验，按照转染试剂说明书进行操做，27℃培养细胞至72h，细胞80％出现感染迹象，收集P1代病毒，重组杆状病毒命名BV-S-ITRs-HA，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V201606。实施例6.重组杆状病毒的扩增方法及滴度测定调整处于对数生长期的Sf9细胞密度为3×106个/mL，把经计算后获得的适量病毒加入细胞悬液中，27℃，70r/min振荡培养至Sf9细胞出现明显病变。收获并保存含病毒的上清液即获得病毒P2储备，再用P2病毒扩培获取P3代储备。实施例7.鸡体免疫程序在哈尔滨兽医研究所的负压隔离器中饲养不含病原体的SPF鸡，14日龄时对8只健康的鸡进行首免，皮下注射滴度为109的病毒样(0.2ml/只)，28日龄以相同剂量进行加强免疫(0.2ml/只)；于14、21、28、35、42、49、56及70日龄随机选取6只免疫鸡，静脉采血，经处理后离心取上层，血清用于免疫效果检测，-20℃保存。实施例8.免疫效果检测定期无菌采集免疫鸡的外周血，制备鸡外周T血淋巴细胞，分别利用ConA和HA蛋白刺激淋巴细胞产生淋巴细胞增殖效应。将外周血淋巴细胞接种到96孔板中，加入100μL含HA蛋白RPMI1640培养液，阳性对照组孔加入100μL含ConA的RPMI1640培养液，阴性对照孔只100μLRPMI1640培养液，于37℃5％CO2的培养箱中培养细胞44h后，每孔20μL5mg/mLMTT溶液，避光培养4h后用酶标仪检测490nm波长下OD值，计算细胞的刺激指数(SI)。重组杆状病毒BV-S-ITRs-HA免疫的鸡血清在HA蛋白刺激下，刺激指数可达到1.139，在ConA的刺激下，刺激指数可达1.233，表现出明显的淋巴细胞增殖反应。此外，在用ELISA试剂盒检测血清中IgG抗体水平、血清中IL-2、IL-4和IFN-γ含量时，发现在2免后的14天(42日龄)，各组水平以及含量均达到最大值，IgG抗体水平为0.966，血清中IL-2、IL-4和IFN-γ含量分别为89.67ng/L、80.21ng/L和64.24ng/L，说明重组杆状病毒疫苗能够刺激机体产生有效的细胞免疫应答和体液免疫应答。在2免后42天(70日龄)，血清中IgG抗体水平、IL-2、IL-4和IFN-γ含量仍维持在较高的水平，IgG抗体水平为0.524，血清中IL-2、IL-4和IFN-γ含量分别为62.7ng/L、50.18ng/L和39.33ng/L。由以上结果可知，重组杆状病毒直接作为禽类疫苗能够有效的增强机体免疫水平，对鸡只提供了免疫保护作用，本发明为重组杆状病毒直接作为禽类疫苗的应用以及其免疫效果的研究奠定了基础。当前第1页1 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