扩增DNA的方法与流程

文档序号:13083750阅读:1188来源:国知局
技术领域本发明涉及扩增DNA的方法,特别涉及扩增单细胞全基因组DNA并对其进行测序的方法。

背景技术:
单细胞全基因组测序技术是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整基因组后进行高通量测序。目前主要的全基因组扩增技术主要有四类:扩增前引物延伸聚合酶链式反(PrimerExtensionPreamplification-PolymeraseChainReaction,简称为PEP-PCR,具体方法参见ZhangL,CuiX,SchmittK,HubertR,NavidiW,ArnheimN.1992.Wholegenomeamplificationfromasinglecell:implicationsforgeneticanalysis.ProcNatlAcadSciUSA.89(13):5847-51.)、退变寡核苷酸引物聚合酶链式反应(DegenerateOligonucleotide–PrimedPolymeraseChainReaction,简称为DOP-PCR,具体方法参见TeleniusH,CarterNP,BebbCE,NordenskjoM,PonderBA,TunnacliffeA.1992.Degenerateoligonucleotide-primedPCR:generalamplificationoftargetDNAbyasingledegenerateprimer.Genomics13:718–25)、多重置换扩增(MultipleDisplacementAmplification,简称为MDA,具体方法参见DeanFB,NelsonJR,GieslerTL,LaskenRS.2001.RapidamplificationofplasmidandphageDNAusingphi29DNApolymeraseandmultiply-primedrollingcircleamplification.GenomeRes.11:1095–99)和多次退火环状循环扩(MultipleAnnealingandLoopingBasedAmplificationCycles,简称为MALBAC,具体方法参见PCT专利申请WO2012166425)。基因测序技术经过了三个发展阶段:第一代DNA测序技术包括化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们基础上发展起来的各种测序技术,其中最具代表性的是1975年由桑格(Sanger)和考尔森(Coulson)提出的链终止法。第一代技术准确率高,读取长,是至今唯一可以进行“从头至尾”测序的方法,但存在成本高、速度慢等方面的不足,并不是最理想的测序方法。随后的二、三代测序技术以高通量为共同特征,也被称为“新一代测序技术(NGS)”。其中第二代测序技术以焦磷酸测序技术、边合成边测序(SBS)技术、以及连接测序技术为代表,经过几年的发展,焦磷酸测序技术以及连接测序技术已很少使用,现在主流的二代测序技术为边合成边测序技术、半导体测序技术以及CG测序技术。第三代测序技术大体分为两类,一类为单分子荧光测序,具有代表性的技术为TSMS技术和SMRT技术,另一类为纳米孔单分子技术。与前两代技术相比,第三代测序技术最大的特点是单分子测序。虽然第三代测序技术取得了一定的进展,但现阶段主流的测序技术仍是第二代测序技术。目前的全基因组扩增技术扩增出的全基因序列无法直接用于二代测序技术。因此,无论是将上述全基因组序列应用于二代测序技术中的边合成边测序技术、半导体测序技术或者CG测序技术,在上机测序之前都需要进行文库制备过程。每种测序技术都具有各自对应的文库制备方法,其中边合成边测序平台的文库制备主要分为两类,一类为片段化DNA经过末端修复后添加Y形接头技术或颈环接头技术,另一类为transpson技术。半导体测序平台的文库制备同样分为两类,一类为片段化DNA经过末端修复后添加接头技术,另一类为transpson技术。CG平台文库制备过程比较复杂,片段化DNA经过末端修复后需要酶切、以及两次环化过程,操作繁琐,耗时较长。当将目前的主流扩增方法扩增出的产物用于上述测序技术时,要么需要另行进行建库,要么测序的效果不佳。因此,目前急需一种能够克服主流扩增方法的一个、多个或全部缺陷的改进的扩增方法。

技术实现要素:
本发明提供了一种扩增细胞基因组DNA的方法和一种用于扩增基因组DNA的试剂盒。在本申请的一个方面中,提供了一种扩增基因组DNA的方法,所述方法包括:(a)提供第一反应混合物,其中所述第一反应混合物包括包含所述基因组DNA的样本、第一引物、核苷酸单体混合物和核酸聚合酶,其中所述第一引物从5’端到3’端包含通用序列和第一可变序列,所述第一可变序列包括第一随机序列,其中所述第一随机序列从5’端到3’端依次为Xa1Xa2……Xan,所述第一随机序列的Xai(i=1-n)均属于同一个集合,所述集合选自B、或D、或H、或V,其中B={T、G、C
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