技术领域本发明属于生物技术领域，特别涉及一种外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法。
背景技术：
裂殖壶菌(Schizochytrium或Aurantiochytrium)是一种海洋真菌，其菌体内积累有大量的DHA，所以它是目前生产DHA的重要菌株。除了DHA之外，裂殖壶菌菌体中也含有角鲨烯等物质。角鲨烯是一种脂质不皂化物，具有增强机体免疫能力、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能，是一种具有防病治病作用的生物活性物质，并广泛应用于医药、化妆品等领域。目前角鲨烯的主要来源是鲨鱼肝油，但渔业资源的枯竭促使人们寻找其他的角鲨烯来源。利用微生物发酵法来生产角鲨烯是一种很有潜力的角鲨烯来源。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。针对现有技术中利用裂殖壶菌进行发酵生产角鲨烯含量低的特点，本发明还有一个目的是提供一种外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法，本发明的方法通过抑制裂殖壶菌合成角鲨烯途径的竞争途径，使更多的前体物质和还原剂流向角鲨烯合成，以提高菌体中的角鲨烯含量。本发明提供的技术方案为：一种外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法，包括如下步骤：在利用裂殖壶菌发酵合成角鲨烯时，在发酵前或发酵中向发酵培养基中添加一定浓度的外源调控因子，以促进角鲨烯的合成，其中，所述外源调控因子为醇。优选的是，所述的外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法中，所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和巴豆醇中的任意一种或几种。优选的是，所述的外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法中，所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和巴豆醇中的任意一种，当所述醇为甲醇时，所述一定浓度为40-100g/L，当所述醇为乙醇时，所述一定浓度为20-50g/L，当所述醇为丙醇时，所述一定浓度为8-20g/L，当所述醇为丁醇时，所述一定浓度为4-10g/L，当所述醇为异丙醇时，所述一定浓度为20-50g/L，当所述醇为异丁醇时，所述一定浓度为4-10g/L，当所述醇为异戊醇时，所述一定浓度为2-5g/L，当所述醇为巴豆醇时，所述一定浓度为4-10g/L。优选的是，所述的外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法中，当所述醇为甲醇时，所述一定浓度为80g/L，当所述醇为乙醇时，所述一定浓度为40g/L，当所述醇为丙醇时，所述一定浓度为16g/L，当所述醇为丁醇时，所述一定浓度为8g/L，当所述醇为异丙醇时，所述一定浓度为40g/L，当所述醇为异丁醇时，所述一定浓度为8g/L，当所述醇为异戊醇时，所述一定浓度为4g/L，当所述醇为巴豆醇时，所述一定浓度为8g/L。优选的是，所述的外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法中，向所述发酵培养基中添加所述外源调控因子的方式为一次性加入、分次加入或者持续流动加入。本发明至少包括以下有益效果：本发明通过添加外源调控因子，抑制合成DHA的多不饱和脂肪酸合成酶途径，实现代谢向甲羟戊酸途径的调控，从而促进角鲨烯的合成，提高裂殖壶菌菌体中角鲨烯含量。依照本发明的方法可显著提裂殖壶菌菌体中高角鲨烯的含量；并且本发明操作简单，不需要额外的人工和设备，仅通过较低的投入，就可利用现有的裂殖壶菌发酵技术实现角鲨烯的生产。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明其中一个实施例中角鲨烯含量测定结果图。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本发明提供一种外源调控因子促进裂殖壶菌合成角鲨烯的方法，包括如下步骤：在利用裂殖壶菌发酵合成角鲨烯时，在发酵前或发酵中向发酵培养基中添加一定浓度的外源调控因子，以促进角鲨烯的合成，其中，所述外源调控因子为醇。在裂殖壶菌胞内，DHA作为一种多不饱和脂肪酸，可以增强细胞膜的流动性和通透性，它的合成途径是多不饱和脂肪酸合成酶途径合成。角鲨烯则是由甲羟戊酸途径合成。这两种途径使用一样的前体(乙酰辅酶A)和一样的还原剂(NADPH)，所以它们互为竞争途径。当在培养基中加入外源调控因子如丁醇等时，这些外源调控因子可通过细胞膜渗入裂殖壶菌细胞，并对细胞产生毒害作用。作为应激反应，裂殖壶菌细胞会抑制多不饱和脂肪酸合成酶途径并减少DHA等多不饱和脂肪酸的合成，使得细胞膜通透性下降，外源调控因子的渗入减少，细胞毒害作用减弱；同时作为多不饱和脂肪酸合成酶途径的竞争途径，甲羟戊酸途径由于得到更多的前体和还原剂而被增强，因而可以促进角鲨烯的积累。依照本发明的方法可显著提裂殖壶菌菌体中高角鲨烯的含量；并且本发明操作简单，不需要额外的人工和设备，仅通过较低的投入，就可利用现有的裂殖壶菌发酵技术实现角鲨烯的大量生产。在本发明的一些实施例中，作为优选，所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和巴豆醇中的任意一种或几种。在上述方案中，所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇和巴豆醇中的任意一种时，作为优选，当所述醇为甲醇时，所述一定浓度为40-100g/L，当所述醇为乙醇时，所述一定浓度为20-50g/L，当所述醇为丙醇时，所述一定浓度为8-20g/L，当所述醇为丁醇时，所述一定浓度为4-10g/L，当所述醇为异丙醇时，所述一定浓度为20-50g/L，当所述醇为异丁醇时，所述一定浓度为4-10g/L，当所述醇为异戊醇时，所述一定浓度为2-5g/L，当所述醇为巴豆醇时，所述一定浓度为4-10g/L。在上述方案中，作为优选，当所述醇为甲醇时，所述一定浓度为80g/L，当所述醇为乙醇时，所述一定浓度为40g/L，当所述醇为丙醇时，所述一定浓度为16g/L，当所述醇为丁醇时，所述一定浓度为8g/L，当所述醇为异丙醇时，所述一定浓度为40g/L，当所述醇为异丁醇时，所述一定浓度为8g/L，当所述醇为异戊醇时，所述一定浓度为4g/L，当所述醇为巴豆醇时，所述一定浓度为8g/L。在本发明的其中一些实施例中，作为优选，向所述发酵培养基中添加所述外源调控因子的方式为一次性加入、分次加入或者持续流动加入。以下实施中，所使用的角鲨烯的测定方法为：冷冻干燥：将发酵液收集在离心管中，离心去上清，用蒸馏水洗涤沉淀2次，再次离心；将沉淀置于冷冻离心机中冷冻干燥24-48小时，直到沉淀重量恒定；称取细胞干重的质量。超声破碎提取油脂：将少量菌体置和蒸馏水置于另一离心管中，漩涡振荡使之充分混匀，然后在冰浴条件下超声破碎；破碎条件为：开3秒，停3秒，循环100次；在离心管中加入正己烷，摇床振荡8小时左右；吸取离心管中上层的有机相，低温减压蒸馏出去溶剂，得到油脂；在测定角鲨烯之前，需要把样品甲酯化。气相色谱法测定角鲨烯：日本岛津GC2010，FID检测器，Rtx-5色谱柱，进样口温度250度，检测器温度260度，柱温150度保持2分钟，然后以8度/分钟升温至250度，保持5分钟。实施例1将裂殖壶菌B4D1接种到发酵培养基中，发酵培养基的组分为葡萄糖80g/L、酵母粉4g/L、大豆蛋白胨4g/L、海水晶15g/L，MgCl2·6H2O6.4g/L、CaCl2·2H2O1g/L、MgSO4·7H2O5g/L、KCl2g/L。在接种后24小时时，分别一次性加入外源调控因子甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、巴豆醇。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中的葡萄糖浓度为0g/L时，停止发酵。实验结果如表1所示：其中细胞干重是指每升发酵液获得的菌体量，角鲨烯含量是指角鲨烯与菌体干重的比例。由表1可以看出，对照组所获得的菌体中，角鲨烯的含量较低，但是在加入了甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、巴豆醇等调控因子后，角鲨烯的含量显著升高。表1实施例2将裂殖壶菌ATCC20888接种到发酵培养基中，发酵培养基的组分为葡萄糖80g/L、酵母粉4g/L、大豆蛋白胨4g/L、海水晶15g/L。在接种后36小时和50小时时，分2次加入外源调控因子甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、巴豆醇，每次加入的浓度为最终外源调控因子浓度的一半。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中的葡萄糖浓度为0g/L时，停止发酵。实验结果如表2所示：表2其中细胞干重是指每升发酵液获得的菌体量，角鲨烯含量是指角鲨烯与菌体干重的比例。裂殖壶菌ATCC20888对外源调控因子的耐受程度较弱，所以可以选择分次加入外源调控因子的策略。由表2可以看出，分次加入外源调控因子的策略同样可以实现促进角鲨烯积累的目的。实施例3将裂殖壶菌B4D1接种到发酵培养基中，发酵培养基的组分为葡萄糖80g/L、酵母粉4g/L、大豆蛋白胨4g/L、海水晶15g/L，MgCl2·6H2O6.4g/L、CaCl2·2H2O1g/L、MgSO4·7H2O5g/L、KCl2g/L。在接种后24小时时，分别一次性加入外源调控因子或者其组合。利用生物传感仪测定培养基中的葡萄糖浓度，当培养基中的葡萄糖浓度为0g/L时，停止发酵。实验结果如表3所示：表3其中细胞干重是指每升发酵液获得的菌体量，角鲨烯含量是指角鲨烯与菌体干重的比例。由表1可以看出，单独加入外源调控因子丁醇或者加入外源调控因子的组合均能增加裂殖壶菌的角鲨烯含量。其中角鲨烯含量以单独加入丁醇8g/L的添加方式为最高。如附图1中，峰1为角鲨烯标准品的检测信号，峰2为添加丁醇后裂殖壶菌油脂样品在相同时间的检测信号。这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的外源调控因子和菌种及发酵培养基的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。如上所述，根据本发明，由于向发酵培养基中添加了外源调控因子-醇，因此提高了裂殖壶菌中角鲨烯含量，效果明显，可应用于大规模生产。且该方法简单方便，具有经济效益。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。