本申请涉及生物
技术领域：
：，具体地，涉及用于血小板发育研究、血小板减少症研究及其大规模备选药物筛选的斑马鱼模型。
背景技术：
：：血小板是血液系统中不可缺少的一部分，它的主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。当血小板出现问题时，机体会呈现疾病状态，例如血小板疾病，是由于血小板数量减少(血小板减少症)或功能减退(血小板功能不全)导致止血栓形成不良和出血而引起的。血小板减少症是外周血中血小板减少而导致皮肤粘膜及内脏出血的疾病，是临床常见的以凝血功能障碍、出血为特点的一组疾病。为了更好地研究血小板的发育和功能，需要寻找到一个能够特异标记血小板的基因，从而构建血小板特异性标记的转基因系，实时跟踪血小板的来源和分化。MPL(MPLproto-oncogene,thrombopoietinreceptor)是促血小板生成素TPO的受体，是一种造血生长因子，在人类与小鼠中调控多种造血祖细胞和血小板的生成。为了更好地研究MPL的功能以及了解人类血小板减少症特别是胚胎发育期的血小板减少症的相关机制，需要构建血小板减少症的突变体，从而建立相应的疾病模型。特别地，现有技术中缺乏作为胚胎发育期的血小板减少症的模型以及适合大规模稳定筛选血小板减少症的备选药物的动物模型。为了更好地研究血小板特别是胚胎发育期的血小板的相关机制，需要构建特异性标记血小板的转基因斑马鱼，可以利用其进行实时观察胚胎期血小板的生成以及发育。对血小板的研究非常必要。斑马鱼产卵多，在体外受精，体外发育且早期胚胎透明，适合在胚胎发育期进行观察以及用于大规模高通量的备选药物筛选。斑马鱼与人的血液组成以及基因调控机制的相似使得斑马鱼已经被用于研究造血发育1。斑马鱼已经作为疾病模式动物用于阐述一些造血疾病的新的分子机制2和筛选新的药物3。已有文献报道CD41可以作为血小板的一个标记物4，文献中已经构建了一种可以标记血小板的转基因斑马鱼，并且细胞分选实验证明CD41:GFPhigh的荧光标记的细胞均为血小板。所以可以利用该转基因斑马鱼系进行血小板减少的突变体筛选，以及药物治疗的实验证明。白细胞介素-11(IL-11)为一种造血生长因子,能促进造血干细胞以及巨噬祖细胞的增殖,并且诱导巨噬细胞成熟,从而升高血小板数量。此类药物用于提升血小板数目在小鼠中已有实验证明，并且也已经成功运用于临床治疗人类的血小板减少症5,6。为了方便对血小板的研究、监测血小板相关疾病治疗效果等，能够特异标记血小板的斑马鱼转基因系尤为重要。技术实现要素：以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。本申请的第一方面提供了一种突变体斑马鱼在制备血小板减少症的动物模型中的用途，其中所述突变体斑马鱼为mplsmu40突变体。在一些实施方案中，所述血小板减少症是由mpl基因的敲除引起的。在进一步的实施方案中，所述血小板减少症可以在通过造血生长因子治疗后症状缓解，所述造血生长因子优选地是白细胞介素-11(IL-11)。本申请的第一方面还提供了一种突变体斑马鱼在筛选对血小板减少症有效的药物中的用途，其中所述突变体斑马鱼为mplsmu40突变体。在一些实施方案中，所述血小板减少症是由mpl基因的敲除引起的。在进一步的实施方案中，所述血小板减少症可以在通过造血生长因子治疗后症状缓 解，所述造血生长因子优选地是白细胞介素-11(IL-11)。在更进一步的实施方案中，所述筛选可以包括以下步骤：(a)以相同浓度的备选药物处理受精后1天到2.5天，优选2天的所述突变体斑马鱼和野生型同胞鱼对照的胚胎；(b)一至两天后观察血小板的数目，以确定所述备选药物对所述血小板减少症的治疗效果。本申请的第一方面还提供了一种利用突变体斑马鱼来筛选对血小板减少症有效的药物的方法，其中所述突变体斑马鱼为mplsmu40突变体。在一些实施方案中，所述血小板减少症是由mpl基因的敲除引起的。在进一步的实施方案中，所述血小板减少症可以在通过造血生长因子治疗后症状缓解，所述造血生长因子优选地是白细胞介素-11(IL-11)。在更进一步的实施方案中，所述筛选可以包括以下步骤：(a)以相同浓度的备选药物处理受精后1天到2.5天，优选2天的所述突变体斑马鱼和野生型同胞鱼对照的胚胎；(b)一至两天后观察血小板的数目，以确定所述备选药物对所述血小板减少症的治疗效果。本申请的第一方面还提供了一种突变体斑马鱼在制备凝血功能障碍的动物模型中的用途，其中所述突变体斑马鱼为mplsmu40突变体。在一些实施方案中，所述凝血功能障碍是由mpl基因的敲除引起的。本申请的第一方面主要涉及但不限于：a.通过TALEN靶向基因敲除技术，得到mpl基因序列缺失的突变体斑马鱼。b.胚胎时期，利用标记不同阶段髓系细胞的探针进行WISH实验来检测详细的血小板数目的改变，用CD41标记成熟血小板细胞，并进行凝血实验检测突变体幼鱼的凝血功能。c.作为血小板减少症的动物模型进行血小板减少症的药物筛选。通过获得的Mpl突变体mplsmu40，发现具有以下表型：①Mpl突变体mplsmu40斑马鱼胚胎血小板数目显著减少。②同时在幼鱼期，Mpl突变体mplsmu40显著影响了机体内的凝血机制。突变体的凝血时间显著延长，并且出血量显著增多。③已经运用白细胞介素11对突变体mplsmu40进行治疗，结果证明，白细胞介素11可以有效提高突变体mplsmu40斑马鱼血小板数目。本申请的第一方面相对于现有技术的进步：可以利用斑马鱼进行胚胎期血小板疾病的研究；并且由于其具有稳定遗传的特性可进行长期疾病追踪和高通量药物筛选。利用本发明的斑马鱼Mpl突变体mplsmu40，能够进行血小板减少症特别是胚胎发育期的血小板减少症的研究，以及针对血小板减少症的治疗的备选药物的大规模筛选。在本申请的第一方面中，Mpl突变体mplsmu40具有稳定遗传的血小板减少的表型，能够进行血小板减少症特别是胚胎发育期的血小板减少症的研究。此外，本申请的Mpl突变体mplsmu40还可以用来扩展研究血栓、凝血功能障碍等与血小板相关的各种疾病机制。本申请的第二方面提供了一种转基因斑马鱼在制备血小板及其前体细胞特异性标记的动物模型中的用途，其中所述转基因斑马鱼为Tg(mpl:eGFP)。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼中，髓系细胞与成熟红细胞不被特异性标记。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼高表达血小板标记基因，低表达髓系基因和血红蛋白基因，其中所述血小板标记基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血红蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼中，GFP+的细胞数目响应于促血小板生成素而显著增多。本申请的第二方面还提供了一种转基因斑马鱼在制备凝血实验的动物模型中的用途，其中所述转基因斑马鱼为Tg(mpl:eGFP)。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼中，髓系细胞与成熟红细胞不被特异性标记。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼高表达血小板标记基因，低表达髓系基因和血红蛋白基因，其中所述血小板标记基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血红蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼中，GFP+的细胞数目响应于促血小板生成素而显著增多。本申请的第二方面还提供了一种转基因斑马鱼在制备用于筛选增加 血小板数目的药物的动物模型中的用途，其中所述转基因斑马鱼为Tg(mpl:eGFP)。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼中，髓系细胞与成熟红细胞不被特异性标记。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼高表达血小板标记基因，低表达髓系基因和血红蛋白基因，其中所述血小板标记基因包括cd41、lrrc32、gp9、kif1b、nfe2，所述髓系基因包括mpo、lyz、mfap4，所述血红蛋白基因包括hbbe1、hbae1。在一些实施方案中，所述转基因斑马鱼中，GFP+的细胞数目响应于促血小板生成素而显著增多。本申请的第二方面进一步提供一种用mpl基因标记的转基因斑马鱼，可以特异性标记血小板，可以用此转基因斑马鱼实时观察血小板的产生、成熟、分化、以及血栓形成等。所述mpl基因标记的转基因斑马鱼还可以用于各种针对血小板相关疾病的治疗的药物效果监测，并可以利用斑马鱼的独特优势进行实时观察药物疗效。所述mpl基因标记的转基因斑马鱼作为极为方便快捷的动物模型，对于研究血小板的发育和功能来说更具有优势。所述转基因斑马鱼为Tg(mpl:eGFP)。本申请的第二方面主要涉及：a.通过Tol2转座子介导技术，得到pTol2-mplpromoter–eGFP转基因斑马鱼。b.胚胎时期，利用不同转基因系斑马鱼细胞标记进行抗体染色共染来检测mpl:eGFP标记的细胞是否为血小板。同时也利用荧光细胞分选方法比较不同血细胞转基因系的细胞特异标记基因的差别。并与已知的Tg(CD41:eGFP)转基因系标记的血小板细胞和造血干细胞进行比较。c.检验mpl:eGFP是否标记为血小板细胞，进行血管损伤实验，以及Tpo(促血小板生成素)诱导增殖实验。通过获得的Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼，发现具有以下表型：①mpl:eGFP转基因系得到可遗传的F0代转基因斑马鱼(F0代特指筛选到的第一代可遗传的转基因母本或父本)，标记的细胞所在位置与mpl探针原位杂交表达位置相同。②通过与髓系转基因系和红系转基因系斑马鱼比较，细胞分选结果 表示，mpl:eGFP+细胞高表达血小板表面蛋白基因，低表达其他谱系的基因。抗体染色结果表明，mpl:eGFP+不与髓系或者血红蛋白共同表达。与已知的CD41:eGFP+细胞比较，mpl:eGFP+的细胞更高表达血小板标记基因。③损伤实验表明，在损伤情况下mpl:eGFP+的细胞会到伤口处，作为血小板的功能表现之一。在Tpo的刺激下，mpl:eGFP+的细胞响应Tpo信号，呈现出显著增多状态。④药物处理实验表明，在给予血小板增多药物白细胞介素-11处理以后，表现出mpl:eGFP+细胞增多，证明了血小板增多药物的有效性。本申请可以很好的展示斑马鱼实时观察的优势，将血小板特异性标记出来，对以后的血小板发育研究以及相关疾病研究以及临床用于增加血小板数目的药物筛选提供了很好的动物模型。在本申请中，Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼系能够将斑马鱼血小板前体细胞和血小板特异性标记为绿色。该转基因系确实具有稳定遗传的血小板荧光标记，可以被用来扩展研究血小板的产生，分化，成熟，功能(例如血栓的形成)，以及与血小板相关的各种疾病机制和进行药物筛选。通过获得的Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼，发现具有以下用途：①绿色荧光特异性标记了斑马鱼血小板。②荧光信号从斑马鱼胚胎受精后2天开始出现，此后逐渐增多。③该转基因系成为一个目前为止最特异性标记血小板的转基因斑马鱼系。为血小板的发育以及功能的研究和药物筛选提供了一个极为简便的工具。本文所使用的术语“dpf”指受精后的天数。举例来说，“3dpf”指受精后第三天，“8dpf”指受精后第八天。本文所使用的术语“hpf”指受精后的小时数。举例来说，“72hpf”指受精后第72小时。本申请所使用的术语“GFP+”是指具有绿色荧光的细胞。本文所使用的术语“野生型”或者“WT”都是指野生型斑马鱼。附图说明图1：TALEN靶向基因敲除技术获得斑马鱼突变体mplsmu40，是一种血小板减少的突变体(A)TALEN靶向基因敲除设计方案，选择斑马鱼mpl基因转录本mpl-001(ENSDART00000124917)，1号外显子序列作为靶点进行基因敲除。(B)经测序得到突变体mplsmu40在靶点位置序列-8bp+48bp的突变，并且突变后Mpl蛋白提前终止，缺失重要功能区域。(C)免疫化学染色结果。尾部信号点为CD41:eGFPhigh的细胞，标记成熟血小板。突变体mplsmu40中，信号点明显减少，说明成熟血小板数目明显减少。(D)WISH检测野生型同胞鱼和突变体mplsmu40的mpl基因表达，突变体mplsmu40中mpl基因的mRNA表达量显著减少。尾部局部放大框为100×放大倍数。(E)血小板相关基因的mRNA表达量结果，黑色柱子代表野生型同胞鱼，灰色柱子代表突变体mplsmu40。横坐标所示这些基因的mRNA表达量在突变体mplsmu40中都明显下调(每组n＝30)。统计学差异由t-检验得出，ns没有显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图2：斑马鱼突变体mplsmu40在凝血实验中表现为凝血功能障碍(A)针刺3dpf的斑马鱼胚胎尾部血管，图示为血液停止流出时的尾部视野野生型同胞鱼(WT，左栏)和突变体(mplsmu40，右栏)，突变体mplsmu40出血量较多，伤口凝血块较大。(B)凝血实验处理野生型同胞鱼和突变体mplsmu40各组至少10条，显微镜下观察其从损伤开始至流血停止的时间。分别在3dpf和6dpf时处理，统计分析凝血时长，突变体mplsmu40尾部血管凝血时长显著多于野生型同胞鱼(每组n≥10)。统计学差异由t-检验得出，ns没有显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图3：白细胞介素-11(IL-11)可以有效提高斑马鱼突变体mplsmu40的血小板数目(A)上图为未注射IL-11的突变体mplsmu40对照组，下图为注射IL-11后的突变体mplsmu40处理组，图示信号点为CD41:eGFPhigh的细胞，代表血小板的数目。注射IL-11后的突变体mplsmu40信号点明显增多。(B、C)对 野生型与突变体mplsmu40同时进行IL-11注射，黑色柱子代表对照组(仅注射蒸馏水)，灰色柱子代表IL-11注射组(注射IL-11)。(B)中结果显示注射IL-11使得野生型同胞鱼中cd41基因的mRNA表达量相对于对照组增多约40％(P＝0.016)；(C)中结果显示，注射IL-11使得突变体mplsmu40中cd41基因的mRNA表达量相对于对照组增多约97％(P＝0.005)。结果说明，突变体mplsmu40响应于IL-11的治疗，并且与在野生型同胞鱼中的作用相比，IL-11能够显著更多地提升突变体mplsmu40的血小板数目。图4：利用Tol2转座子介导技术，pTol2-mplpromoter-eGFP转基因斑马鱼的获得(A)Tol2转座子介导技术设计方案，选择斑马鱼mpl基因转录本mpl-201(ENSDART00000057297)，二号外显子ATG序列为止，向前4641bp作为mpl启动子区域。(B)上方小图标出了斑马鱼胚胎期造血部位示意图。AGM:主动脉-性腺-中肾；CHT：尾部血岛；下图左侧为野生型胚胎2.5dpfAGM区域和2.5dpf及5dpfCHT区域mpl基因原位杂交的图示；右侧为Tg(mpl:eGFP)胚胎进行GFP抗体染色结果。两者表达部位结果相同。(C)在Tg(mpl:eGFP)胚胎中进行GFP与Lcp1(髓系细胞表达基因)抗体共染结果，上：红色为Lcp1+细胞，中：绿色为GFP+细胞，下：为两者叠加在一起的图示，结果为没有任何重叠细胞。说明Lcp1与GFP没有共同表达的细胞，即GFP不标记髓系细胞。(D)在Tg(mpl:eGFP)胚胎中进行GFP与Hbae1(α血红蛋白，标记所有成熟红细胞)抗体共染，上：红色为Hbae1+细胞，中：绿色为GFP+细胞，下：为两者叠加在一起的图示，结果为没有任何重叠细胞。说明Hbae1与GFP没有共同表达的细胞，即GFP不标记成熟红细胞。(E)本申请实施例5的Tg(mpl:eGFP)与Tg(coronin1a:eGFP)的胚胎分别进行GFP流式细胞分选，其中coronin1a标记所有髓系细胞。两者GFP+细胞进行qPCR的检测结果。结果显示mpl-GFP+细胞与coronin1a-GFP+细胞相比，高表达血小板基因cd41，而低表达或不表达髓系细胞表达的基因。(F)Tg(mpl:eGFP)与Tg(gata1:DsRed)的胚胎分别进行绿色荧光GFP和红色荧光DsRed流式细胞分选，其中gata1标记所有红系细胞。两者GFP+和DsRed+细胞进行qPCR的检测结果。结果显示 mpl-GFP+细胞与gata1-DsRed+细胞相比，高表达血小板基因cd41和lrrc32，而低表达血红蛋白基因(hbbe1、hbae1)(每组n＝30)。统计学差异由t-检验得出，ns没有显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。(G)Tg(mpl:eGFP)与Tg(CD41:eGFP)的胚胎分别进行GFP流式细胞分选，其中cd41标记斑马鱼造血干细胞和血小板细胞。两者GFP+细胞进行qPCR的检测结果。结果显示mpl-GFP+细胞与CD41-GFP+细胞，虽然均高表达血小板标记基因(从左至右依次：gp9、kif1b、lrrc32、nfe2)，但这些血小板标记基因在mpl-GFP+细胞中比在CD41-GFP+细胞中的表达显著更高。图5：Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼标记细胞为血小板细胞，可以响应于损伤反应以及Tpo和白细胞介素-11。(A)在4dpfTg(mpl:eGFP)的胚胎中进行血管损伤实验，损伤部位为颈部血管，GFP+的细胞响应损伤，并可抵达损伤部位，这为血小板功能之一。(B)在Tg(mpl:eGFP)的胚胎中显微注射tpo的mRNA，3dpf的胚胎中，GFP抗体染色的结果显示，注射了tpomRNA的胚胎显著增多了GFP+的细胞数目。(C)与已转入Tg(mpl:eGFP)转基因背景的同胞鱼野生型Tg(mpl:eGFP)相比，在血小板减少的mplsmu40；Tg(mpl:eGFP)突变体中mpl-GFP+细胞显著减少。(D)白细胞介素-11可以显著地提升Tg(mpl:eGFP)中mpl-GFP+细胞数目。每组n≥10，统计学差异由t-检验得出，ns没有显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。在阅读并理解了附图和详细描述后，可以明白其他方面。具体实施方式下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。材料与方法TALEN靶向基因敲除技术TALEN靶点识别模块由北京唯尚立德生物科技有限公司构建，将TALEN质粒对通过显微注射方法注射到斑马鱼胚胎单细胞中可实现靶基因敲除7。实验中，设计了斑马鱼mpl基因转录本mpl-001,一号外显子上的一段序列TTTGGGATGCACCT(SEQIDNO:1)作为TALEN间隔区域，合成左右两边的靶点识别TALEN模块质粒，对其进行定向敲除。Tol2转座子介导技术启动子序列从NCBI获取，斑马鱼mpl基因转录本mpl-201二号外显子ATG序列为止，向前4641bp作为mpl启动子区域。将启动子序列和eGFP序列与转座子序列连接、克隆、转化，终制备成pTol2-mplpromoter-eGFP质粒。斑马鱼突变体筛选TALEN显微注射得到的第一代突变体为F0代，将每个F0代个体与野生型杂交得到F1代，将F1代成鱼剪尾测序得到不同序列插入或者缺失的突变体，利用mpl原位杂交信号是否减少，CD41:GFP荧光信号是否减少进行表型筛选，经过测序，得到靶点间隔区域序列突变(-8bp+48bp)(TTTGAAAAGACTTTGAAGACTTGAAAAGACTTTTGCTTTTGAAAAGACTTTGCT)(SEQIDNO:2)的mplsmu40突变体斑马鱼。斑马鱼转基因系筛选pTol2-mplpromoter-eGFP显微注射得到的第一代突变体为F0代，F0代于3dpf到4dpf挑出带有荧光标记、并且荧光表达位置正确的胚胎，将每个GFP+F0代个体培养至个体性成熟，与野生型杂交得到F1代，同时检测F1代3-4dpf胚胎是否稳定遗传荧光标记。经过荧光标记表型筛选， 得到稳定遗传的标记斑马鱼血小板的转基因斑马鱼品系Tg(mpl:eGFP)。斑马鱼的饲养与繁殖野生型、突变体mplsmu40斑马鱼和转基因斑马鱼系Tg(mpl:eGFP)的培养方法如现有技术所述8。对于本文中提及的所有实验，斑马鱼胚胎均被置于含有0.003％苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)以及0.002％美兰的胚胎培养液中，以去除胚胎色素。整体原位杂交(whole-mountinsituhybridization,WISH)地高辛标记的反义RNA探针的合成以及WISH操作均按照标准实验操作流程完成9。使用的mpl探针序列为：AACAGCAGGTGACATAGAGTTCAGGTGCCACACTTCTGATCTGATTCAAATCATTTGCAAATGGAGGGGAGACTTATATAAGGACAATACATACAGCTTCTACTATAAACAATTAAACAGAAGTTCATGGAGCAGTTGGAAGTTGTGTCCCAATTGCAATAACTCCATCCATCAGTGTGTCCTGTATGGCCAGAAGTCCAATGTCTTTAAGTTTTACCTCAATACAGGGTTGCAACCATTCAGCCGAACATTTTATGCAGAGACTTTCTATATGAACAGTAAAGTTCAGACAAGGCCTCCAGAAGGTCTGAAGGTACAGATTGGGGAAGAAAGGCTTTGTTTGACATGGGATTCACCATTTCTGATCATTTCTAAGCATCTAATGTACCAGATCCGTTATCAGCATCATGAAGAGAATCAGTGGAAGGGTTTTAAAGCTTCTGGATCCAAGACCAGCACTTGTCTAGATGTGCACAGAGGGGGTCGATACACCATCCAGGTTCGAGCACAACCCAATGGATCTGTGTACAGCGGAAACTGGAGTGACTGGTCAAAACCTGTTACAACCAACCTACCTTTAAGCAAAGAGTGGATTATTTTTGTTTGCATACCAGTGGCTCTGATCATCATTGCAACTGCAGTCATCTCTTTCTTCTCCAGATACTTCCGAAAGGTCAAGAGGTCCCTGTGGCCACCAGTACCAAACCTTAACAAGGTCCTGGAAAACATCCTGACTGATATCAGTGGATCACACTGGGAGCCAACCTTCAACATTAAGCAATGTGATGATGACACTGCTACATCAGTGGTGGAGGTTCTCACTGAGGGGGAATCTGCGGTCAAAACCTGTAAGAACACCTGTCCTCTGCTCTCTGAGCACAGTGAAAAACATGGAGAACATTTCAGAGAGGACTTGGAAATGGCGCAAGATTATGTGATTTTGA ACAACAATATAATCCCCTGCCTTACGGGAAACGACTACGTGTATAAGGATGTTGCTTCAACACATCTGGCCAATGAAAAACAACACTCTTGCTCCAGCACTTCTTACACCTCCCTACCAGATCACACCACAGATATTCTCAACCAATCCTATCTCCTTTTGGCAGAACAATCCGATCTTGGGGCGTATCAAACAACCTGTGGCCAGTACACCAATCTGGAGATCACAGCAGTATCATGTGTAGCAATTGGAGAGTGAGGTTTACTGTCAAAATGAAGCTCATAATCATGTATATATTAAGGGTTCTCTCACAAATGTAAAAAAGACATTCAGTTTCTGTGGAATGAATGAGAAACAAAGGAAAAGCAAAGCTTACGTTAATGGAGCACTTATGAAGGTAATC(SEQIDNO:17)。免疫化学染色(Immunochemistrystaining)运用Anti-GFPantibody(Biotin)(ab6658)一抗(购买自abcam公司)，Donkeyanti-GoatIgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa488conjugate二抗(购买自invitrogen公司)，donkeyanti-rabbitAlexa-555(购买自Invitrogen)，以及Lcp1和Hbae1一抗(由香港科技大学馈赠)10，将突变体mplsmu40与转基因品系斑马鱼Tg(CD41:eGFP)交配4，从而获得带有Tg(CD41:eGFP)转基因背景的突变体mplsmu40。对其进行免疫化学染色，操作方法如本领域已知的11；利用同样方法对带有Tg(mpl:eGFP)转基因背景的斑马鱼系进行免疫化学染色，荧光显微镜下观察高亮绿色荧光的细胞，其数量将代表血小板细胞的数量。qRT-PCR使用RocheTripureRNAIsolationReagent(购买自Roche公司)来提取斑马鱼胚胎的总RNA，其操作步骤按照相关说明执行。使用M-MLV反转录酶(Promega)，来制备cDNA，其操作步骤按照相关说明执行。用斑马鱼基因β-actin作为内参进行qRT-PCR，操作方法如本领域已知的12。qRT-PCR引物序列斑马鱼尾部凝血实验利用0.03mm直径的显微注射用针(borosilicateglasscapillaries1B100F-4，购买自WorldPrecisionInstrumentsInc公司)，作为损伤工具，选取受精后72至84小时的斑马鱼胚胎进行尾部凝血实验。将斑马鱼胚胎放在含有0.02％三卡因(tricaine)的胚胎培养液中麻醉，然后置于琼脂糖平板上。利用显微注射从尾部内侧血管区域进行针刺损伤。数量为野生型同胞鱼和突变体mplsmu40各110条以上。显微镜下观察计时，从损伤开始到凝血块形成，流血停止。药物实验选用齐鲁制药有限公司生产的巨和粒注射用重组人白细胞介素-11，选取受精后48-52hpf的斑马鱼胚胎进行药物注射。选取颈部或者卵黄囊表面血管注射。浓度为6μg/μL，每个胚胎用药约5ng。观察一天后，对斑马鱼胚胎进行血小板计数。斑马鱼颈部凝血实验利用0.03mm直径的显微注射用针(borosilicateglasscapillaries 1B100F-4，购买自WorldPrecisionInstrumentsInc公司)，作为损伤工具，选取受精后4dpf的斑马鱼胚胎进行颈部凝血实验。将斑马鱼胚胎放在含有0.02％三卡因(tricaine)的胚胎培养液中麻醉，然后置于琼脂糖平板上。利用显微注射从颈部卵黄囊上侧血管区域进行针刺损伤。数量为10条以上。从损伤开始到血小板到达损伤处血栓形成在显微镜下观察计时。Tpo实验选用mMSSAGEmMACHINESP6Kit(AM1340)购买自公司，体外合成tpomRNA，选取受精后1个细胞时期的Tg(mpl:eGFP)斑马鱼胚胎，进行单细胞显微注射。浓度为800g/μL，每个胚胎用量约400pg。观察3天后，对斑马鱼胚胎进行GFP抗体染色。流式细胞分选选取各转基因系斑马鱼即Tg(mpl:eGFP)、Tg(coronin1a:eGFP)10全部髓系细胞特异性标记转基因系、Tg(gata1:DsRed)13全部红系细胞特异性标记转基因系、Tg(CD41:eGFP)4血小板以及造血干细胞标记转基因系斑马鱼，于4dpf时期，各转基因系取200个以上的斑马鱼胚胎进行绿色荧光或者红色荧光细胞分选实验，实验具体方法参照文献所述14。实施例1.mpl基因序列缺失的突变体斑马鱼的获得本实验中，设计了斑马鱼mpl基因转录本mpl-001ENSDART00000124917,一号外显子上的一段序列TTTGGGATGCACCT作为TALEN间隔区域，合成左右两边的靶点识别TALEN模块质粒，对其进行定向敲除，得到了一个缺失8bp、插入48bp的Mpl蛋白提前终止的突变体mplsmu40(参见图1A、图1B)。mpl基因表达为了检测突变的有效性，以mpl作为标记血小板和血小板前体细胞的标记基因。利用原位杂交技术，检测3dpf的野生型同胞鱼和mplsmu40突变体中mpl基因的mRNA表达情况。结果如图1D中所示，信号点代表mpl基因的mRNA表达情况。结果显示，突变体mplsmu40中的mpl基因的mRNA表达量与野生型同胞鱼相比 有非常明显的减少。实施例2.本发明实施例1的突变体斑马鱼可作为血小板减少症的动物模型血小板数目取5dpf的斑马鱼胚胎，将突变体mplsmu40与转基因品系斑马鱼Tg(CD41:eGFP)交配4，获得带有Tg(CD41:eGFP)转基因背景的突变体。对野生型同胞鱼进行同样处理。对带有Tg(CD41:eGFP)转基因背景的mplsmu40突变体和野生型同胞鱼进行免疫化学染色，在荧光显微镜下观察血液中流动的血小板中高亮荧光的细胞，信号点为CD41:eGFPhigh的信号点，其数量将代表血小板细胞的数量。结果如图1C所示，mplsmu40突变体中血小板数目与野生型同胞鱼相比大幅度减少。多个与血小板相关的基因的mRNA表达选取了mpl、cd41、lrrc32、gp1bb、fog1、nfe2这些已有文献报道与血小板相关的基因15-18，对5-dpf野生型同胞鱼与突变体mplsmu40斑马鱼胚胎进行荧光定量PCR实验。这些基因中，Lrrc32、Gp1bb都是血小板膜蛋白；Fog1与Nfe2，是与哺乳动物巨核细胞产生和成熟相关的转录调控因子。结果如图1E所示，表明，这些基因在突变体mplsmu40中的mRNA水平都显著低于野生型同胞鱼，说明突变体mplsmu40确实是血小板减少的突变体。总之，以上结果表明，在突变体mplsmu40中，由于mpl基因的敲除，血小板的数目显著减少。由此，本发明实施例1的mplsmu40突变体可作为血小板减少症的动物模型。实施例3.利用本发明实施例1的突变体斑马鱼进行由血小板减少症引起的凝血功能障碍模型构建。由于突变体mplsmu40表现为血小板减少，所以可以用该突变体来研究血小板对斑马鱼止凝血的作用，进而构建斑马鱼凝血功能障碍实验模型19。 首先利用3dpf的斑马鱼胚胎，每组至少10条，分别对野生型同胞鱼组和突变体mplsmu40组的斑马鱼进行尾部血管针刺损伤，通过光学显微镜镜下20倍观察血管损伤后伤口血块大小，并记录每一条斑马鱼胚胎从损伤开始出血的时间到出血停止的时间。图2A所示为血管损伤后伤口血块大小，左图为野生型同胞鱼，右图为突变体mplsmu40，可以明显区别出相比于野生型同胞鱼，mplsmu40突变体损伤后伤口出血量较多，伤口附近形成的血块较大。凝血时长的具体实验数据见下表。分别对3-dpf和6-dpf的斑马鱼进行实验，对数据进行了两样本t检验，以确定野生型同胞鱼组和突变体mplsmu40组两组间是否存在显著性差异。结果见图2B，所示为每组凝血时长的统计图。mplsmu40突变体的凝血时长显著地比野生型同胞鱼更长。以上结果表明，mplsmu40突变体可作为血小板减少导致的凝血功能障碍的模型，以利于后续研究。实施例4.利用本发明实施例1的突变体斑马鱼进行备选药物筛选由于mplsmu40突变体表现为血小板减少，所以选取了临床针对血小板减少症的常用药物对其进行药物治疗。选择了IL-11，其通过增加血系祖 细胞的增殖来得到血小板增加的效果。如图3A所示，IL-11注射一天后，观察突变体中血小板的数目。上图为对照组(仅仅注射蒸馏水)，下图为注射IL-11组，可以明显看到CD41:eGFPhigh信号点增多。同时还使用qPCR实验进行定量分析，结果如图3B-C所示，在野生型同胞鱼和突变体mplsmu40中注射IL-11后均出现cd41基因的mRNA的表达量上调，但在突变体mplsmu40中的上调倍数显著更大97％(P＝0.005)，相比于野生型同胞鱼中的40％(P＝0.016)。图3B-C的结果说明，突变体mplsmu40响应于IL-11的治疗，并且与在野生型同胞鱼中的作用相比，IL-11能够显著更多地提升突变体mplsmu40的血小板数目。以上结果表明，可以利用本发明的mplsmu40突变体作为动物模型，对那些针对mpl基因缺陷引起的血小板减少症的备选治疗药物进行药物筛选。实施例5.Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼的获得本实验中，设计了斑马鱼mpl基因转录本mpl-201二号外显子ATG序列为止，向前4641bp作为mpl启动子区域，将此段序列(SEQIDNO:30)插入到pTol2转座子质粒中，合成pTol2-mplpromoter-eGFP，对野生型斑马鱼胚胎DNA进行基因插入，得到了一个能够特异性标记血小板的转基因斑马鱼系Tg(mpl:eGFP)。图4A示出了Tol2转座子介导技术设计方案。图4B中，上方小图标出了斑马鱼胚胎期造血部位示意图，其中AGM:主动脉-性腺-中肾；CHT：尾部血岛。下方的图中，左侧为野生型胚胎2.5-dpfAGM区域及2.5-dpf和5-dpfCHT区域mpl基因原位杂交的结果，右侧为对转基因斑马鱼系Tg(mpl:eGFP)胚胎进行GFP抗体染色的结果。两者表达部位结果相同，说明GFP的荧光表达位置确实是mpl基因表达的位置。以上结果表明，获得了转基因斑马鱼系Tg(mpl:eGFP)。实施例6.本发明实施例5的转基因系斑马鱼的特征的研究mpl不标记成熟红细胞和髓系细胞取4dpf的斑马鱼胚胎Tg(mpl:eGFP)，对其进行免疫化学染色，在荧 光显微镜下观察Lcp1(髓系细胞)20与Hbae1(成熟红细胞)21染色结果，信号点分别为Lcp1、Hbae1与mpl-GFP+的信号点，其数量将代表各类细胞的数量。结果如图4C-D所示，Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼胚胎中不存在mpl与lcp1或mpl与hbae1共同表达的细胞。说明，本发明的Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼系Tg(mpl:eGFP)中，髓系细胞和成熟红细胞没有被特异性标记。与已存在的斑马鱼转基因系比较，mpl-GFP+细胞高表达血小板标记基因，低表达其他谱系基因。以mpl作为标记血小板和血小板前体细胞的标记基因，coronin1a作为标记髓系细胞的标记基因，gata1作为标记全部红系细胞的标记基因，利用流式细胞分选技术，检测4dpf的Tg(coronin1a:eGFP)10，Tg(gata1:DsRed)13，Tg(CD41：eGFP)4和本发明实施例5的Tg(mpl:eGFP)中DsRed+细胞和GFP+中的mRNA表达情况。结果如图4E-F所示，Tg(mpl:eGFP)中GFP+的细胞均高表达血小板基因(cd41，lrrc32)，低表达或不表达髓系基因(mpo，lyz，mfap4)22-24和血红蛋白基因(hbbe1，hbae1)21。结果显示，mpl不标记成熟红细胞和髓系细胞。进一步地，选取了gp9、lrrc32、kif1b、nfe215,17,18,25这些已有文献报道与血小板相关的基因，对4-dpfTg(CD41:eGFP)4和本发明实施例5的Tg(mpl:eGFP)斑马鱼胚胎分别进行绿色荧光蛋白GFP流式分选，将分选得到的细胞进行荧光定量PCR实验。结果如图4G所示，表明，这些与血小板相关的基因在mpl-GFP+的细胞中比在CD41-GFP+的细胞中具有显著更高的表达，说明本发明实施例5的Tg(mpl:eGFP)转基因系斑马鱼确实是更特异标记血小板的转基因系斑马鱼。实施例7.利用本发明实施例5的转基因系斑马鱼进行凝血模型和Tpo以及白细胞介素-11增殖血小板响应机制构建。由于本转基因系斑马鱼可以很好地荧光可视化标记的血小板，所以可 以用此转基因品系来研究血小板对斑马鱼止凝血的作用，从而构建斑马鱼凝血实验模型19。首先利用4dpf的斑马鱼胚胎，每组至少10条，对本发明实施例5的Tg(mpl:eGFP)转基因系斑马鱼胚胎进行颈部血管针刺损伤，通过光学显微镜下64倍观察血管损伤后GFP+细胞是否到达损伤处。如图5A所示，血管损伤后mpl-GFP+的细胞可到达损伤处，作为血小板的功能之一，左图为损伤后1min，右图为3min，3min血栓面积比1min血栓面积大，说明血栓面积随时间增大。由于血小板主要生成途径为Tpo/Mpl，当给予Tpo时，血小板会响应于Tpo而大量增殖26。通过免疫荧光染色技术，在Tg(mpl:eGFP)中注射tpomRNA以后，观察mpl-GFP+的细胞数目是否会明显增多。如图5B所示，对单细胞时期Tg(mpl:eGFP)进行显微注射tpomRNA，检测3dpfTg(mpl:eGFP)斑马鱼胚胎GFP+细胞增殖情况。结果显示，Tpo使得GFP+的细胞明显增多。利用本发明实施例1的突变体斑马鱼mplsmu40，我们观察了在血小板减少症模型当中mpl-GFP+细胞是否会减少。如图5C所示，通过免疫荧光染色技术检测mplsmu40；Tg(mpl:eGFP)(将实施例1的mplsmu40纯合突变体与实施例5的Tg(mpl:eGFP)转基因系斑马鱼杂交，对其后代筛选得到既有mplsmu40基因突变又具有Tg(mpl:eGFP)转基因背景的斑马鱼系，将其命名为mplsmu40；Tg(mpl:eGFP))中，4-dpf斑马鱼胚胎GFP+细胞与已转入Tg(mpl:eGFP)转基因背景的野生型同胞鱼相比，统计结果显示GFP+细胞数目显著减少。我们还研究了白细胞介素-11作为增加血小板的药物之一，是否也可以作用于Tg(mpl:eGFP)，使得GFP+的细胞增多。如图5D所示，通过免疫荧光染色技术检测在注射了IL-11的斑马鱼胚胎Tg(mpl:eGFP)中，相比于对照组，GFP+细胞显著增多，结果说明本发明Tg(mpl:eGFP)转基因斑马鱼可作为血小板药物筛选模型。以上结果表明，Tg(mpl:eGFP)转基因系确实可作为血小板特异性标记的可视化模型，以利于后续研究。综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。参考文献1.OrkinSH,ZonLI.Hematopoiesis:anevolvingparadigmforstemcellbiology.Cell.2008；132:631-644.2.StoletovK,KlemkeR.Catchoftheday:zebrafishasahumancancermodel.Oncogene.2008；27:4509-4520.3.SuzanneR,HeatonWL,DeepaJ,etal.Zebrafishscreenidentifiesnovelcompoundwithselectivetoxicityagainstleukemia.Blood.2012；119:5621-5631.4.LinHF.AnalysisofthrombocytedevelopmentinCD41-GFPtransgeniczebrafish.Blood.2005；106:3803-3810.5.PeetersK,StassenJ,CollenD,VanGeetC,FresonK.Emergingtreatmentsforthrombocytopenia:Increasingplateletproduction.DrugDiscovToday.2008；13:798-806.6.Thrombocytopeniainthenewborn.CurrOpinPediatr.1992；88:217-218.7.HuangP,XiaoA,ZhouM,ZhuZ,LinS,ZhangB.HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.NatBiotechnol.2011；29:699-700.8.WesterfieldM.Thezebrafishbook:aguideforthelaboratoryuseofzebrafish(Daniorerio):M.Westerfield；2007.9.ThisseC,ThisseB.Thisse,C.&Thisse,B.High-resolutioninsituhybridizationtowhole-mountzebrafishembryos.Nat.Protoc.3,59-69.NatureProtocol.2008；3:59-69.10.LiL,YanB,ShiYQ,ZhangWQ,WenZL.LiveImagingRevealsDifferingRolesofMacrophagesandNeutrophilsduringZebrafishTailFinRegeneration.JBiolChem.2012；287:25353-25360.11.JinH,SoodR,XuJ,etal.Definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishVDAandPBI.Development.2009；136:1397.12.WangK,FangX,MaN,etal.Myeloperoxidase-deficientzebrafishshowanaugmentedinflammatoryresponsetochallengewithCandidaalbicans.FishShellfishImmun.2015；44:109-116.13.YaqoobN,HolottaM,PremC,KoppR,SchwerteT.Ontogeneticdevelopmentoferythropoiesiscanbestudiednon-invasivelyinGATA-1:DsRedtransgeniczebrafish.ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartA:Molecular&IntegrativePhysiology.2009；154:270-278.14.DuL,XuJ,LiX,etal.RumbaandHaus3areessentialfactorsforthemaintenanceofhematopoieticstem/progenitorcellsduringzebrafishhematopoiesis.Development.2011；138:619-629.15.LANGMR,GIHRG,GAWAZMP,MLLERII.HemostasisinDaniorerio:isthezebrafishausefulmodelforplateletresearch？JThrombHaemost.2010；8:1159-1169.16.Timme-LaragyAR,KarchnerSI,FranksDG,etal.Nrf2b,NovelZebrafishParalogofOxidant-responsiveTranscriptionFactorNF-E2-relatedFactor2(NRF2).JBiolChem.2012；287:4609-4627.17.AmigoJD,AckermannGE,CopeJJ,etal.TheroleandregulationoffriendofGATA-1(FOG-1)duringblooddevelopmentinthezebrafish.Blood.2009；114:4654-4663.18.O'ConnorMN,SallesII,CvejicA,etal.Functionalgenomicsinzebrafishpermitsrapidcharacterizationofnovelplateletmembraneproteins.Blood.2009；113:4754-4762.19.JagadeeswaranP,LiuYC.Ahemophiliamodelinzebrafish:analysisofhemostasis.BloodCellsMolDis.1997；23:52-57.20.JinH,SoodR,XuJ,etal.Definitivehematopoieticstem/progenitorcellsmanifestdistinctdifferentiationoutputinthezebrafishVDAandPBI.Development.2009；136:1397.21.AlisonB,CandaceH,OatesAC,etal.Characterizationofembryonicglobingenesofthezebrafish.DevBiol.2003；255:48-61.22.BermanJN,KankiJP,AThomasL.Zebrafishasamodelformyelopoiesisduringembryogenesis.ExpHematol.2005；33:997-1006.23.LieschkeGJ,OatesAC,CrowhurstMO,WardAC,LaytonJE.Macrophagesinembryonicandadultzebrafish:morphologicandfunctionalcharacterization.Blood.2001；98:3087-3096.24.ZakrzewskaA,CuiC,StockhammerOW,BenardEL,SpainkHP,MeijerAH.Macrophage-specificgenefunctionsinSpi1-directedinnateimmunity.Blood.2010；116:e1-e11.25.ShivdasaniRA,RosenblattMF,Zucker-FranklinD,etal.TranscriptionfactorNF-E2isrequiredforplateletformationindependentoftheactionsofthrombopoietin/MGDFinmegakaryocytedevelopment.Cell.1995；81:695-704.26.SvobodaO,StachuraDL,MachoOvaO,etal.Dissectionofvertebratehematopoiesisusingzebrafishthrombopoietin.Blood.2014；124:220-228.当前第1页1 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