本发明属于茶蛋白技术领域。更具体地，涉及一种具有降血压活性的绿茶蛋白多肽及其制备方法和应用。
背景技术：
世界范围内高血压发病率有逐年增高的趋势，防治高血压是全球医务界面临的一项艰巨任务。随着社会发展，人们对自身的健康意识不断增强，已不仅仅满足于现有药物的防治效果，对防治的安全性也提出了越来越高的要求。具有降血压作用的多肽在体外也被称为ACE抑制肽。自1965年Ferreira首次在南美茅头蝮蛇毒液中发现了ACE抑制肽，不断有新的ACE抑制肽从不同的动植蛋白资源中提取分离出来。目前用于研究ACE抑制肽蛋白质大致分为两类：植物蛋白和动物蛋白。目前，植物来源以大豆蛋白为主；动物来源以乳蛋白和水产品蛋白为主。
另外，我国拥有丰富的茶叶资源，在茶叶的生产、加工等各项过程中产生了大量茶渣。这些茶渣中仍含有很多营养物质，具有较高的潜在应用价值，却因为没有很好的被利用而造成浪费。茶叶蛋白占茶叶干重的20～30％，其中98％以上是非水溶性蛋白，因此茶渣是提取制备植物蛋白质的理想原料。目前已有从大豆蛋白，乳蛋白，南瓜叶蛋白中提取制备降血压肽的研究，目前研究也表明茶叶蛋白具有抗氧化、降血脂、抗辐射等功能性质，但对于茶叶蛋白降血压多肽的制备和研究鲜有报道，国内外尚未见有关于以茶叶(茶渣)为来源的ACE抑制肽的相关研究和报道。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种具有降血压活性的绿茶蛋白多肽及其制备方法和应用。
本发明的目的是提供所述具有降血压活性的绿茶蛋白多肽的制备方法。
本发明另一目的是提供所述具有降血压活性的绿茶蛋白多肽的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种具有降血压活性的绿茶蛋白多肽的制备方法，包括如下步骤：
S1.破壁：采用酶解技术对茶渣进行酶解破壁处理；
S2.碱提：步骤S1酶解后的茶渣继续采用碱法提取茶蛋白，得到茶蛋白提取液；
S3.酸沉：对S2所得茶蛋白提取液进行酸沉，得沉淀物；
S4.脱盐：对S3所得沉淀物进行脱盐；
S5.脱色：取S4脱盐后的茶蛋白，利用75％丙酮进行脱色，冷冻干燥得到绿茶蛋白；
S6.酶解：取S5所得的绿茶蛋白加入食物蛋白酶进行酶解，得到具有降血压活性的绿茶蛋白多肽。
其中，所述绿茶茶渣可以为浸提后的废弃绿茶茶渣。
另外，优选地，步骤S6所述食物蛋白酶为酸性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶或碱性蛋白酶。
更优选地，步骤S6所述食物蛋白酶为酸性蛋白酶。
更优选地，所述酸性蛋白酶为和氏璧酸性蛋白酶(Acidprotease)。
优选地，步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.0～4.0％，酶解pH为1.8～8.0，酶解温度为37～60℃，酶解时间为2～4h。
更优选地，步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.0～4.0％，酶解pH为2.5～4.0，酶解温度为40～50℃，酶解时间为2～4h。
更优选地，步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.0％，酶解pH为4.0，酶解温度为40℃，酶解时间为2h。
优选地，步骤S1所述酶解破壁所使用的酶为复合植物水解酶。
更优选地，所述复合植物水解酶为诺维信复合植物水解酶ViscozymeL。
优选地，步骤S1所述酶解的参数为：酶浓度为1.5～3.5％，固液比为1:20～1:30，酶解pH为2.5～4.0，酶解温度为37～45℃，酶解时间为2～4h。
优选地，步骤S2所述碱提的参数为：碱液浓度为0.10～0.15mol/L，固液比为1:30～1:50，提取温度为80～90℃，提取时间为90～150min；离心得到绿茶蛋白提取液。
优选地，步骤S3所述酸沉是取绿茶蛋白提取液，用稀盐酸调节pH为2.5～3.5，静置30～60min后离心，得到沉淀物。
优选地，步骤S4所述脱盐是在沉淀物中加入水混匀，注入透析袋中，置于纯水中透析36～48h，期间更换纯水4～6次，直至透析袋外水无色且电导率接近纯水，然后3500～4000r/min离心15～20min得到脱盐后的绿茶蛋白。
优选地，步骤S5所述脱盐后的绿茶蛋白和75％丙酮的用量比为：固液比1:5～1:8。
优选地，步骤S5所述脱色的方法是：取S4脱盐后的绿茶蛋白，加入75％丙酮，震荡15～20min，离心弃上清，重复数次，用纯水洗涤并离心，重复数次以洗净丙酮，得到绿茶蛋白。
另外，由上述制备方法制备得到的具有降血压活性的绿茶蛋白多肽，以及所述绿茶蛋白多肽在制备降血压药物或具有降血压功能的茶叶功能性食品方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种酶法提取具有降血压活性绿茶多肽的方法，在温和的条件下采用蛋白酶催化水解绿茶蛋白生成具有降血压活性的多肽片段，具有反应条件温和、原料来源广泛、易控制、专一性强等优点，既不会导致营养成分的损失，也不会产生毒性方面的问题。
本发明提供的具有降血压活性绿茶多肽在研究开发具有降血压功能的茶叶功能性食品以辅助或代替药物治疗方面具有很好的应用前景，对高血压的防治以及出以及茶叶资源的创新利用都具有重要意义。
附图说明
图1为高降血压活性绿茶蛋白多肽提取工艺流程图。
图2为不同食物蛋白酶酶解绿茶多肽的ACE抑制活性对比图。
图3为酶解温度对酸性蛋白酶酶解绿茶蛋白的酶解产物ACE抑制率和水解度的影响图。
图4为酶解时间对酸性蛋白酶酶解绿茶蛋白的酶解产物ACE抑制率和水解度的影响图。
图5为酸性蛋白酶酶浓度对绿茶蛋白的酶解产物ACE抑制率和水解度的影响图。
图6为酸性蛋白酶酶解pH值对绿茶蛋白的酶解产物ACE抑制率和水解度的影响图。
图7为高降血压活性绿茶多肽对SHR大鼠血压的影响图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1具有降血压活性的绿茶蛋白多肽的制备
1、制备方法流程图如附图1所示，包括如下步骤：
S1.破壁：采用酶解技术对绿茶茶渣进行酶解破壁处理；
S2.碱提：步骤S1酶解后的绿茶茶渣继续采用碱法提取绿茶蛋白，得到绿茶蛋白提取液；
S3.酸沉：对S2所得绿茶蛋白提取液进行酸沉，得沉淀物；
S4.脱盐：对S3所得沉淀物进行脱盐；
S5.脱色：取S4脱盐后的绿茶蛋白，利用75％丙酮进行脱色，冷冻干燥得到绿茶蛋白；
S6.酶解：取S5所得的绿茶蛋白加入食物蛋白酶进行酶解，得到具有降血压活性的绿茶蛋白多肽。
其中，所述绿茶茶渣为浸提后的废弃绿茶茶渣。
步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.0～4.0％，酶解pH为2.5～4.0，酶解温度为40～50℃，酶解时间为2～4h。
步骤S1所述酶解破壁所使用的酶为诺维信复合植物水解酶ViscozymeL。
步骤S1所述酶解的参数为：酶浓度为1.5～3.5％，固液比为1:20～1:30，酶解pH为2.5～4.0，酶解温度为37～45℃，酶解时间为2～4h。
步骤S2所述碱提的参数为：碱液浓度为0.10～0.15mol/L，固液比为1:30～1:50，提取温度为80～90℃，提取时间为90～150min；离心得到绿茶蛋白提取液。
步骤S3所述酸沉是取绿茶蛋白提取液，用稀盐酸调节pH为2.5～3.5，静置30～60min后离心，得到沉淀物。
步骤S4所述脱盐是在沉淀物中加入水混匀，注入透析袋中，置于纯水中透析36～48h，期间更换纯水4～6次，直至透析袋外水无色且电导率接近纯水，然后3500～4000r/min离心15～20min得到脱盐后的绿茶蛋白。
步骤S5所述脱盐后的绿茶蛋白和75％丙酮的用量比为：固液比1:5～1:8。
步骤S5所述脱色的方法是：取S4脱盐后的绿茶蛋白，加入75％丙酮，震荡15～20min，离心弃上清，重复数次，用纯水洗涤并离心，重复数次以洗净丙酮，得到绿茶蛋白。
实施例2不同食物蛋白酶处理对绿茶蛋白多肽体外降血压活性的影响
1、方法
按照实施例1的方法，步骤S6所述酶解中分别利用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解这几种食物蛋白酶进行处理，最后得到绿茶蛋白多肽。
2、体外检测上述制备的各个绿茶蛋白多肽的降血压活性(抑制ACE酶活性)，并设置卡托普利阳性对照组。
3、实验结果表明：如图2所示，上述5种酶酶解所得肽的ACE抑制活性由强到弱排列为：酸性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶>碱性蛋白酶>中性蛋白酶。其中，酸性蛋白酶酶解所得绿茶多肽活性最佳，ACE抑制率为70.01％，仅仅比化学合成的降血压药物卡托普利的抑制率(80.67％)稍低。
实施例3酸性蛋白酶酶解温度的优化
1、在固定酸性蛋白酶用量为2％，pH值为3.0，在反应时间为3h的条件下，分别选择35、40、45、50、55℃作为步骤S6的酶解条件进行试验，测定内反应体系的水解度和所得酶解产物的ACE抑制率。
2、结果如图3所示，绿茶蛋白酸性蛋白酶酶解液的ACE抑制率和水解度均呈现先升高后降低的趋势，在45℃时抑制率最大达到，同时水解度也最大达到。这可能是由于温度35～45℃在到之间时，酶的空间结构基本保持不变，所以水解度逐渐上升；但当温度升高到50℃时，ACE抑制率下降速度较快，水解度也有所下降，可能是高温条件下部分酶失活所致。综合考虑，选取45℃作为最佳酶解温度进行后续正交实验设计。
实施例4酸性蛋白酶酶解时间的优化
1、在固定酸性蛋白酶用量为2％，pH值为3.0，在反应温度为45℃的条件下，分别选择酶解时间为1、2、3、4、5h作为酶解条件进行试验，测定内反应体系的水解度和所得酶解产物的ACE抑制率。
2、结果如图4所示，随着酶解时间的增加，绿茶多肽的水解度开始缓慢上升，3.5h时水解度达到最高值58％，随后随着时间增加又逐渐下降。绿茶多肽的ACE抑制率随着水解时间也呈现出先升高后降低的趋势，在水解3h时达到最大值73％，此时水解度为54％，也处于较高的水平。由于ACE抑制率为主要考察指标，考虑酶解时间延长对多肽的生产周期、成本都不利，因此选择3h作为最佳酶解时间进行后续正交实验设计。
实施例5酸性蛋白酶的酶浓度的优化
1、在固定酸性蛋白酶酶解反应pH值为3.0，温度为45℃，时间为3h的条件下，分别选择酶浓度为1％、2％、3％、4％、5％作为酶解条件进行试验，测定内反应体系的水解度和所得酶解产物的ACE抑制率。
2、结果如图5所示，当酸性蛋白酶浓度为1％～4％时，绿茶蛋白酶解液的水解度逐渐升高，4％酶浓度时蛋白酶解液水解度为最高52％，后又有所下降，是因为底物浓度一定情况下，随着酶添加量的增加，大量蛋白质分子被水解为小分子多肽，反应体系的初速度随酶用量的增大逐渐增大，酶加量越大对蛋白质的酶解作用越强，生成的短肽越多水解度也越大。当加酶量增加到一定值时，由于可供酶切的底物位点有限，体系中的酶全部将底物酶解后，即使再增加蛋白酶的用量，DH也变化不大。酶解后绿茶活性多肽的ACE抑制率随着酶浓度的增加也呈现先升高后降低的趋势，3％酶浓度下酶解所得到的活性多肽ACE抑制率最高，为72％，此时蛋白水解度也有49％，接近最高值。因此选择3％为酶解最佳酶浓度进行下一步实验。
实施例6酸性蛋白酶的酶解pH值的优化
1、在固定酸性蛋白酶用量为2％，酶解反应温度为45℃，反应时间为3h的条件下，分别选择酶解pH值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0作为酶解条件进行试验，测定内反应体系的水解度和所得酶解产物的ACE抑制率。
2、结果如图6所示，在酶解反应pH值为3.0时，ACE抑制率达到最大，ACE抑制率为73％，该pH条件下，蛋白酶解液的水解度也达最大值51％。因此选择3.0作为其最佳的酶解pH值。
实施例7酸性蛋白酶酶解高降血压活性多肽的工艺优化
1、根据上述实施例的酶解条件优化的结果，设计四因素三水平正交实验(见表1)，用自变量A、B、C、D分别表示酶解温度(℃)、酶解时间(h)、酶浓度(％)、pH值4个因素，以ACE抑制率为考察指标。
表1L9(34)正交试验的因素水平设计
2、结果如表2～表4所示。
表2正交试验结果
表3模型直观分析
表4模型方差分析
由表3的直观分析结果和表4方差分析结果可看出，D因素pH值对提取的绿茶多肽ACE抑制率有显著影响，A因素温度、B因素时间、C因素酶浓度对ACE抑制率的影响不显著。
本试验以绿茶多肽ACE抑制率为主要考察指标，ACE抑制率越高越好。对pH值进行分析，确定最优水平为D3(pH为4.0)；温度、时间、酶浓度对ACE抑制率的影响较小，选择A1(40℃)、B1(2h)、C1(2％)；优水平组合为A1B1C1D3。
因此，酶解最佳工艺条件为：20g/L的绿茶蛋白在酸性蛋白酶用量2％，反应体系pH4.0，酶解温度为40℃的条件下水解2h。对优化的实验结果进行HPLC测定，优水平组合实测值为77％，表明该方法下酶解绿茶蛋白得到的ACE抑制肽活性较高，从而证明了优化设计与分析方法较为准确。
实施例8体内降血压实验
1、实验方法
(1)实验分组：
采用40只12周龄的雌性SHR大鼠(300-350g左右)和10只雌性12周龄Wistar大鼠编号后随机分成5组，具体分组如下表5所示：
表5实验分组与剂量：
(2)实验步骤
采用尾袖法测定大鼠尾动脉收缩压，测定血压之前，将大鼠在25℃条件下保温，稳定后进行测定，每次重复测定3次，取平均值即为初始尾动脉血压。按上述剂量一次性给药后，观察各个实验组随时间变化的血压值，每只大鼠每次测定血压3次，取平均值，测量时间分别为给药后0.25,0.5,1,2,4,6,8h。
2、结果如表6和附图7所示。
表6绿茶蛋白多肽对SHR大鼠血压的影响
由表6可知，对A，B，C三组中SHR大鼠灌胃不同剂量的本发明的绿茶蛋白多肽后，三组SHR大鼠的血压值均显著下降。灌胃绿茶蛋白多肽1h后A，B，C三组大鼠血压达到最低值，接近WKY大鼠正常血压水平，随后血压值开始逐步上升。其中A，B两组的血压下降幅度达22.4％，血压最低值与WKY大鼠正常血压接近，C组次之。
各组血压随时间变化趋势如图7所示，D组SHR空白组血压维持在162.3±1.0mmHg的高水平，E组WKY空白组的血压维持在120±2.3mmHg的正常水平。