本发明涉及鱼肠道弧菌的检测方法，具体涉及鱼肠道弧菌LAMP检测方法。
背景技术：
鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)是水产养殖中新发现的一种革兰氏阴性致病菌,呈杆状,两端钝圆,散在或成双,无芽孢,可感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、石鲽(Kareiusbicoloratus)等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损失。
目前，针对鱼肠道弧菌的检测技术主要是PCR法、DNA杂交法和菌落杂交法。然而，由于这些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁琐、费时费力，很难推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据靶序列设计四条特异性引物，可以特异性识别靶序列的六个特定区域，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可以在1小时内对靶序列实现109倍的扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可以通过肉眼直接观察。LAMP检测方法具有特异、灵敏、快速、简便等特点，适合基层养殖场对病原的快速检测。
技术实现要素：
本发明提供了一种鱼肠道弧菌LAMP的检测方法，目的是实现对鱼肠道弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：1、提供2对LAMP引物序列，长度分别为46bp，46bp，18bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3；2、配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对样品模板进行扩增，确定最佳反应体系和反应条件；3、反应产物的鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。具体包括如下步骤：
1、设计LAMP引物：根据GenBank已发表的鱼肠道弧菌的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，设计合成四条引物
ToxR-FIP引物：5’-AAGCGTAACCATGCCGCCAC-TACGCGTGGTGTCTATAGCA-3’
ToxR-BIP引物：5’-AGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TGGTTTATGAATTGCCCCCT-3’
ToxR-F3引物：5’-TTTGCCGCTCAGCTAACC-3’
ToxR-B3引物：5’-CCCAACCCCAAGTTGAGTT-3’
2、配制LAMP反应体系
反应体系的终浓度为：外引物F3和B3各5mM，内引物FIP和BIP各20mM,dNTP0.25mM，Tris-Cl20mM，KCl10mM,(NH4)2SO410mM，MgSO44mM，0.1％TritonX-100，8UBstDNA聚合酶和1μl样品模板，加灭菌双蒸水使反应体系总体积达到25μl。
3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58到65℃，反应时间为15到90min.
4、扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。
本发明提供的鱼肠道弧菌LAMP检测方法，有以下优势：
一、灵敏度高对鱼肠道弧菌的检测灵敏度比普通PCR高100倍。
二、特异性强所需的特异性引物根据鱼肠道弧菌的ToxR基因的六个不同区域进行设计，特异性比常规PCR强。
三、检测时间段1h左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。
四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可以进行电泳，也可以直接加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。
五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不涉及复杂仪器设备，产物加入SYBRGreenI染料，可以直接用肉眼观察判断。
综上所述，本发明具有比现有的PCR技术检测鱼肠道弧菌的方法，有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中用于现场检测，有利于及时发现鱼类养殖中的鱼肠道弧菌感染。
附图说明
图1鱼肠道弧菌LAMP反应温度的优化。反应温度温度梯度从左往右依次58℃到65℃8个梯度，泳道1，3，5，7，9，11，13，15分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃的阴性对照；泳道2，4，6，8，10，12，14，16分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃加模版；M：marker。
图2鱼肠道弧菌LAMP反应时间的优化。泳道1-6分别为15min,30min,45min,60min,75min,90min；M为marker。
图3鱼肠道弧菌LAMP检测方法(A)与普通PCR检测方法(B)的灵敏度比较。M:Marker；泳道1-8分别为4×106,4×105,4×104,4×103,4×102,4×101,4×100和4×10-1CFUperreaction；N:negativecontrol。
图4SYBRGreenI显色反应。匀浆后的肝、肾及进行LAMP扩增，产物加入SYBRGreenI，感染组显示绿色，对照组无变化。离心管1，3，5，7分别为感染组大菱鲆脾、肾、肝、血组织的扩增结果；离心管2，4，6，8分别为健康组大菱鲆脾、肾、肝、血组织的扩增结果。
图5鱼肠道弧菌LAMP检测方法的应用。平板计数法结合-双重LAMP计数细菌的最低检出率。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1鱼肠道弧菌LAMP方法的建立
1.1材料
dNTPs、BstDNA聚合酶(含10×缓冲液)、PCR级甜菜碱、MgSO4
1.2方法
1.2.1引物设计与合成
根据GenBank已发表的鱼肠道弧菌ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，设计四条特异性引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
ToxR-FIP引物：5’-AAGCGTAACCATGCCGCCAC-TACGCGTGGTGTCTATAGCA-3’
ToxR-BIP引物：5’-AGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TGGTTTATGAATTGCCCCCT-3’
ToxR-F3引物：5’-TTTGCCGCTCAGCTAACC-3’
ToxR-B3引物：5’-CCCAACCCCAAGTTGAGTT-3’
1.2.2LAMP扩增条件的优化
优化反应温度和反应时间。检测所用的模板用煮沸裂解法制备。分别在温度和时间上设置的不同梯度，进行优化。温度上从58℃到65℃每隔1℃设置一个梯度；时间上15min一个梯度，设置6个梯度。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
分析温度电泳图：反应在65℃条带亮度较暗，反应较弱；当反应在58℃59℃60℃61℃，62℃，63℃，和64℃都有明亮的阶梯状条带(图1)，其中，64℃亮度较其他温度条带亮度亮。因此可以选择64℃为LAMP检测鱼肠道弧菌的反应温度。
分析时间电泳图：在反应在进行到45-90min均可扩增出明亮的梯状条带(图2)，可以选择45min作为反应时间即可达到快速检测鱼肠道弧菌的目的。
实施例2鱼肠道弧菌LAMP检测方法的灵敏度测定
1煮沸法提取DNA。
2为了检测LAMP方法的灵敏度，将提取鱼肠道弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，共8个梯度，各浓度级分别取1μL作为模版,进行优化条件后的LAMP扩增,扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
3分别取1μL作为PCR模板，F3,B3各1μL，Taq酶0.5μL，dNTPs(2.5mMeach)1μL，Taq10×buffer2.5μL,ddH2O18μL，进行PCR扩增，94℃预变性5min；94℃变性30s,57℃退火40s，72℃延伸40s,25个循环；72℃延伸5min。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
图3(B)表明常规PCR方法最低可以检测到4×105CFU/ml(4×102CFU/反应管)，图3(A)表明本申请LAMP检测方法最低可以检测到4×103CFU/ml(4CFU/反应管)，灵敏度比普通PCR高100倍。
实施例3鱼肠道弧菌LAMP检测方法的特异性
1用煮沸法制备鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)，大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi),创伤弧菌(Vibriovulnificus)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，大肠杆菌(E.coli)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的DNA模板,进行LAMP扩增，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果只有鱼肠道弧菌有扩增条带，其他菌株均无条带。(见表1)
表1：鱼肠道弧菌LAMP检测方法的特异性
“+”表示阳性，“-”表示阴性
实施例4鱼肠道弧菌LAMP方法具体检测鱼体内的鱼肠道弧菌
1人工感染鱼肠道弧菌，24h后取感染鱼的肝、肾、脾和血液，加PBS匀浆，平板计数，剩余部分煮沸，进行LAMP扩增，反应结束后，加入SYBRGreenI，感染鱼的反应管显示绿色，对照组的反应管无变化(见图4)。
2结合平板计数法，对煮沸制得的样品10倍梯度稀释，进行LAMP反应，计算得到各细菌感染组中所取组织脾、肾、肝和血液中细菌检出率分别为:7.6CFU/反应、13CFU/反应、10CFU/反应和9.3CFU/反应(见图5)。
序列表