本发明涉及医学领域，是一种肝细胞癌相关的用于检测的生物学标志物，具体为一种用于检测HBV相关肝细胞癌的生物学标志物及方法。
背景技术：
HCC是全球第六大常见肿瘤（每年新增749000例），第三死亡率肿瘤（每年死亡692000例）。此外，许多国家的HCC的发生率逐年升高。近年来，尽管HCC的治疗上已有诸多改进，但HCC患者的预后以及5年生存率仍旧不甚乐观（约0-10%）。造成这一现状的主要原因是缺乏早期诊断和监测的有效手段。许多病人一经诊断已处于疾病的末期，丧失了治疗的机会。目前，最为常用的HCC筛查手段是血清AFP和超声。然而，它们均存在局限性。AFP的灵敏度与特异性并不能有效诊断和监测。而超声的诊断率则依赖于操作者的专业水平、肝硬化的出现、肿瘤大小以及病人的数据等。肝穿刺是一个确诊HCC的有效手段，但是它可能造成针道转移。因此，发现一个有效的非侵袭性的生物学标志物用于HCC的早期诊断和监测是一个非常迫切的需求。
启动子的高甲基化可造成抑癌基因沉默是常见的表观遗传学调控，它在包括HCC在内的多种肿瘤的致癌过程中发挥重要作用。而且，一些研究发现恶性肿瘤能够在疾病的早期阶段向血液释放数量可观的基因DNA，包括甲基化的DNA序列。此外，许多研究也证实细胞游离DNA（cf-DNA）的甲基化状况与原发肿瘤组织高度一致，这提示我们，血清或血浆的甲基化状况可能被用作包括检测和诊断HCC在内的癌症的一个新型非侵袭性生物学标志物。近年来，HCC患者的血清或者血浆中的诸多基因，譬如p16、p15、GSTP1、RASSF1A与SFRP1均被发现存在异常甲基化，并且可以被用作HCC早期测定和诊断的非侵袭性标志物。
技术实现要素：
为了解决以上的技术问题，本发明提供了一种用于检测以HBV相关肝细胞癌的生物学标志物，以及利用此生物标志物的肝细胞癌检测方法，以下是具体技术方案：
一种用于检测以HBV相关肝细胞癌的生物学标志物，包括胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）和甲胎蛋白（AFP）。
利用该生物标志物即IGFBP7和AFP来进行的肝细胞癌检测方法是通过测定标志物IGFIBP7基因启动子甲基化水平和检测标志物AFP联合血清IGFBP7基因启动子甲基化的灵敏度来进行判断。
用于检测血清IGFBP7基因启动子区甲基化状态的引物，包括甲基化引物，其中甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：
(5'-3')GGTAAAGTCGGGGTAGTAGTCG；
甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：
(5'-3')ACAACCGCTCGAATAAATAATACCG。
用于检测血清IGFBP7基因启动子区甲基化状态的探针为taqman探针，其中甲基化引物的探针序列为：
(5'-3')6FAM-CGCTACCGCACACCGAATAACGACTCTTA-BHQ-1。
用于检测血清IGFBP7基因启动子区甲基化状态的试剂盒内包括无核酶水、缓冲液、上下游引物、Taqman探针和亚硫酸盐修饰后的DNA，其中缓冲液由FastStartTaqDNA聚合酶、反应缓冲液、MgCl2和三磷酸脱氧核苷酸混合液组成。
越来越多的证据表明DNA甲基化可能被用作HCC的非常有前景的生物学标志物。但是现有技术主要聚焦于肿瘤组织的DNA甲基化的，它具有创伤且不易获得的缺点。而且，上述研究对DNA启动子甲基化的诊断价值的探讨相对较少。本发明是首次采用定量的方法来检测HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平。本发明选用Methylight的方法进行甲基化定量检测。数据显示HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平显著高于CHB与HC。而且，存在血管侵袭的HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平明显高于无血管侵袭HCC患者。这为血清IGFBP7基因甲基化水平与血清AFP水平联合用于HCC的诊断提供了证据。
目前，AFP是应用最广的HCC筛查标志物。然而，AFP的临床价值受限于其低灵敏度(22%-60%)和特异性(65%-94%)。近年来，越来越多的表观遗传学研究揭示细胞游离甲基化DNA能够在血液中检测到。由于其无创、便捷、易重复，使DNA甲基化用于HCC的诊断与监测成为可能。目前已发现HCC患者血清p16、RASSF1A、TFP12、XPO4、CCND2等基因高甲基化，它们中的一部分可有助于提高诊断效能或预后预测。但是，包括目前大多数研究均选用MSP的方法用于检测甲基化状态。MSP是一个定性检测的方法，诊断效能相对较低，并不能提供更细节、精确的信息。我们的研究选用Methylight，这一相对定量检测法用于测定血清IGFBP7基因甲基化水平。数据显示HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平显著高于CHB和HC。此外，血清IGFBP7基因甲基化水平的AUC接近AFP的AUC，这提示血清IGFBP7基因甲基化水平可能是一个有效的HCC标志物。AFP在20ng/ml的截断点上,血清IGFBP7基因甲基化水平与AFP水平联合能够将灵敏度从60%提升至78.8%。AFP在200ng/ml的截断点上,血清IGFBP7基因甲基化水平与AFP水平联合能够将灵敏度从33.8%提升至72.5%。AFP在200ng/ml的截断点上,血清IGFBP7基因甲基化水平与AFP水平联合能够将灵敏度从26.3%提升至70.0%，这些数据表明双指标联合使灵敏度得到了很大的提升，使对病人的检测更加准确。虽然，双指标联合的特异性低于AFP单指标，但是双指标联合的约登指数在AFP的截断点是200和400ng/ml显著升高，表明了AFP不同的截断点上，血清IGFBP7基因甲基化水平与AFP水平联合能够提高HCC的诊断效能。
附图说明
图1为HCC、CHB和正常对照组人群IGFBP7基因启动子甲基化水平对比图；
图2为IGFBP7基因甲基化水平与血清AFP水平的受试者工作特征曲线图。
具体实施方式
一种用于检测以HBV相关肝细胞癌的生物学标志物，包括胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）和甲胎蛋白（AFP），利用该生物标志物来进行的肝细胞癌检测方法是通过测定标志物IGFBP7基因启动子甲基化水平和检测标志物AFP与血清IGFBP7基因启动子甲基化水平联合后的灵敏度来进行判断。
用于检测血清IGFBP7基因启动子区甲基化状态的引物，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：
(5'-3')GGTAAAGTCGGGGTAGTAGTCG；
甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：
(5'-3')ACAACCGCTCGAATAAATAATACCG。
用于检测血清IGFBP7基因启动子区甲基化状态的探针为taqman探针，其中甲基化引物的探针序列为：
(5'-3')6FAM-CGCTACCGCACACCGAATAACGACTCTTA-BHQ-1。
用于检测血清细胞IGFBP7基因启动子区甲基化状态的试剂盒内包括无核酶水、缓冲液、上下游引物、Taqman探针和亚硫酸盐修饰后的DNA，其中缓冲液由FastStartTaqDNA聚合酶、反应缓冲液、MgCl2和三磷酸脱氧核苷酸混合液组成。
实施例
1、血清DNA提取与亚硫酸盐修饰：
从200ul血清中提取DNA。测定DNA浓度和纯度后，置于-20℃备用。20ul提取的DNA经由EZDNAMethylation-GoldKitTM试剂盒进行亚硫酸盐修饰。修饰后的DNA用作模板进行MethyLight检测。
2、基于Taqman探针的定量甲基化聚合酶链式反应(MethyLight)：
血清IGFBP7基因启动子甲基化水平经由Methylight测定。IGFBP7基因启动子甲基化引物序列和探针，选取Alu-C4基因作为参照基因。IGFBP7基因甲基化引物序列：
上游引物:(5'-3')GGTAAAGTCGGGGTAGTAGTCG;
下游引物:(5'-3')ACAACCGCTCGAATAAATAATACCG;
探针序列:(5'-3')6FAM-CGCTACCGCACACCGAATAACGACTCTTA-BHQ-1。Alu-C4引物序列:
上游引物:(5'-3')GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA;
下游引物:(5'-3')ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA;
探针序列:(5'-3')6FAM-CCTACCTTAACCTCCC-TAMRA.
MethyLight反应体系10ul，由1.5ul无核酶水、5ul缓冲液由FastStartTaqDNA聚合酶、反应缓冲液、MgCl2和三磷酸脱氧核苷酸混合液组成、0.4ul上下游引物、0.2ulTaqman探针和2.5ul亚硫酸盐修饰后的DNA。MethyLight由LightCycler480(Roche,Basel,Switzerland)检测。
反应条件为：95℃10min,随后95℃15s，60℃1min，45个循环。人类DNA,由SssI甲基化酶处理和亚硫酸盐修饰(Qiagen,Germany)用作甲基化对照。PCR反应重复两次，每个反应板包含至少3个用作阴性对照的无模板对照和阳性对照。PMR用于计算甲基化率，计算公式为：PMR=100%×2exp[DeltaCt(样本目的基因－样本对照基因)－DeltaCt(参照样本100%甲基化基因－参照样本对照基因)]。
3、统计学分析：
分类变量由百分率(%)表示。定量变量由中位数（四份位数）表示。Chi-squared检验用于比较分类变量。Student’st-检验或单因素（ANOVA）用于比较定量变量。HCC、CHB与HC组间PMR的比较选用Kruskal-WallisH检验。依据临床指标，PMR在HCC亚组间比较选用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisHtest。受试者工作特征曲线面积(AUC)用于评估血清IGFBP7基因启动子甲基化水平与血清AFP水平的诊断价值。单独AFP与二者联合将HCC从CHB中诊断出来的约登指数间比较用Z检验。P<0.05认为有统计学意义。
4、结果
4.1、三组研究对象血清IGFBP7基因启动子甲基化水平：
本研究包括135例研究对象，其中80例HCC，35例CHB，20例HC。HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平显著高于CHB患者和HC人群。
4.2、HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平与临床病理特征：
存在血管侵袭的HCC患者血清IGFBP7基因启动子甲基化水平显著高于无血管侵袭的HCC患者。但是，血清IGFBP7基因启动子甲基化水平与年龄、性别、HBeAg、吸烟、饮酒、肿瘤数目、肿瘤大小、组织学分级、TNM分级、CTP分级或Barcelona-Clinic-Liver-Cancer(BCLC)分级间无相关联系(P>0.05)。
4.3、血清IGFBP7基因甲基化水平作为HCC的生物学标志物的诊断价值：
受试者工作特征曲线(ROC)用于评估AFP血清IGFBP7基因甲基化水平对HCC的诊断价值。血清IGFBP7基因甲基化水平的AUC是0.695(SE,0.049;95%CI,0.6-0.791)，接近AFP的AUC(SE,0.049;95%CI,0.595–0.787)(p>0.05)，表明血清IGFBP7基因甲基化水平可能是一个有效的HCC标志物。
比较AFP单指标与血清IGFBP7基因甲基化水平与AFP联合对HCC的诊断价值。AFP的截断点选取常用的20、200和400ng/ml。血清IGFBP7基因甲基化水平在截断点为2.5%时有最佳的灵敏度和特异性（灵敏度60.0%,特异性77.1%,约登指数37.1）。AFP在20、200和400ng/ml的截断点上分别有60.0%、33.8%和26.3%的灵敏度；而在上述截断点上，AFP水平联合血清IGFBP7基因启动子甲基化则有相对高的灵敏度，分别为78.8%、72.5%和70.0%。在上述截断点上，AFP的特异性分别为54.3%、91.4%和97.1%；而二者联合的特异性则分别为40.0%、71.4%和74.3%。与AFP单指标相比，在上述三个截断点上，二者联合能够分别将约登指数从14.3、25.2、23.4提高到18.8、43.9、44.3。
本发明公开了HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平显著高于CHB和HC。血清IGFBP7基因甲基化水平能够增强AFP对HCC的诊断价值。血清IGFBP7基因甲基化水平与AFP联合可能是重要的HCC非侵袭性生物学标志物。同时，存在血管侵袭的HCC患者血清IGFBP7基因甲基化水平明显高于无侵袭患者。因此，血清IGFBP7基因甲基化水平可能是预测HCC预后的有效指标。