本发明涉及一种同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，更进一步涉及一种用免疫捕获三重RT-PCR技术同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法。
背景技术：
百合病毒自20世纪40年代被发现以来，已成为危害百合种球生产和鲜切花品质的世界性病害；至今被发现侵染百合病毒有20多种，其中百合隐症病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)、百合斑驳病毒(Lilymottlevirus，LMoV)和黄瓜瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）是发生较普遍、危害严重的3种病毒。
LSV属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，是正义单链RNA病毒；LSV基因组为不分段RNA，全长为8394bp，5′端含帽子结构，3′端有polyA尾巴，共有6个开放阅读框(ORF)，编码4个蛋白，依5′至3′分别编码：RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，三基因连锁结构(TGBp1-3)，外壳蛋白(CP)和核酸结合蛋白；LSV的ORF1为RdRp，编码一个蛋白(220kD)，与病毒在植物体内复制有关；ORF2、ORF3和ORF4分别编码TGBp1、TGBp2和TGBp3(25kD，12kD，7kD)，是病毒在宿主体内运动的3个基因序列互相重叠的运动蛋白(MP)；ORF5为CP，编码唯一参与病毒颗粒形态构成的蛋白质(32kD)；ORF6推测是核酸结合蛋白(16kD)，该蛋白含有一个CysZ-CysZ结构的锌指结构域。
LMoV属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属（Potyvirus），病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小（650～900）nm×（11～15）nm；病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly（A）尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0kDa的多聚蛋白；多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白（CP）等10个不同大小的功能蛋白；LMoVCP亚基由274aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。
CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，在世界范围内均有分布，宿主范围遍布于双子叶植物和单子叶植物，已经阐明的就多达1000种以上；CMV病毒颗粒分子量在5000～67000kDa之间，病毒体RNA含量占18%，蛋白质含量82%，衣壳蛋白分子量为24.5KDa；A260/A280大约1.7；病毒颗粒为正20面体球状，直径28～30nm；RNA由四条RNA分子组成，RNA1和RNA2被分别包被，RNA3和RNA4则被包被于同一衣壳中。
防治百合病毒病较有效的手段是采用无毒繁殖材料或进行脱毒快繁，而这有赖于灵敏、快速和可靠的检测技术；基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的酶联免疫吸附法（ELISA）和基于病毒核酸的RT-PCR检测是目前较为广泛的检测病毒的方法；然而，ELISA检测一个反应体系只能完成一种病毒的检测，不能实现同步检测多种病毒；RT-PCR虽然可以对多种病毒实现同步检测，但是检测必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留多酚和多糖会严重影响检测的灵敏性和特异性；免疫捕获RT-PCR或IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR另种方法的优点，具有较高的灵敏度，且更加简便高效，更重要的是不用提取RNA，检测成本低，不受多糖多酚的影响，非常适合百合、水仙、郁金香种球的病毒检测；关于免疫捕获RT-PCR，目前已有用该方法检测多种植物病毒的相关报道，但是已建立的检测体系都仅能完成一种单一病毒的检测，至今未见用该方法同步检测两种或多种病毒的相关报道。
为了进一步提高检测效率，降低试验成本，本发明对现有的免疫捕获RT-PCR反应进行了改进，实现了用该方法同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒；具体是在免疫捕获RT-PCR反应的第一部分将通常单一的免疫反应改进为复合的免疫反应，即PCR管壁上同时捕获LSV、LMoV和CMV粒子；第二部分将第一链cDNA的合成改进为第一链cDNAs混合物的合成；第三部分将单一的PCR反应改进为了三重PCR检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供一种快速、准确、简便地用免疫捕获三重RT-PCR同时检测LSV、LMoV和CMV的方法。
整个检测方法省略了RNA提取过程，利用三种病毒抗体的特异性，迅速捕获三种目的病毒，从而高效快速的获得目的片段，为球茎类作物病毒的准确检测提供了快捷特异的方法，从而完善了免疫捕获RT-PCR技术。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种同步检测LSV、LMoV和CMV的方法，其特征在于包括以下步骤：
①LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体被包被在同一个PCR反应管中，高效特异捕获LSV、LMoV和CMV粒子；
②利用LSV、LMoV和CMV的特异性引物进行三重反转录聚合酶链式反应RT-PCR；
③琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。
上述进行三重反RT-PCR的引物为LSV、LMoV和CMV的特异性引物。
采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤②获得的反应产物，LSV、LMoV和CMV的目标电泳条带分别出现在198、395和248碱基对(bp)处。
本发明是将免疫学检测技术和分子生物学检测技术有机的结合起来，吸附在PCR管壁上的LSV、LMoV和CMV多克隆抗体能特异性捕获检测样品中的LSV、LMoV和CMV粒子，起到浓缩和纯化病毒的作用，又利用PCR技术放大了检测的灵敏度，可用于感病样品低浓度病毒的检测；该发明省去了普通RT-PCR中提取总RNA的繁琐步骤，大大降低了检测成本；另一方面由于抗原与抗体的结合，提高了检测的特异性；利用免疫捕获PCR还可以避免球根类花卉种球中富含的多糖和多酚对RT-PCR的干扰，因而该技术尤其适合对百合种球鳞茎LSV、LMoV和CMV进行准确的检测，从而从种源上严格控制LSV、LMoV和CMV对百合产业的危害，减少经济损失。
附图说明
图1为本发明实施例百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的电泳检测图
图中：
M：600bpMarker；
1：阴性对照；
2：LSV+LMoV+CMV感病组织；
3：阳性对照。
具体实施方式
本发明的实施例采用如下步骤：
1.引物设计
根据LSV、LMoV和CMV的CP基因序列，设计了LSV、LMoV和CMV的特异性正向和反向引物，引物序列为：LSV-F（5’-TATGGGCTTCCAATACAAC-3’）/LSV-R（5’-TATTCGGTTTCCAGGTTC-3’），LMoV-F（5’-TGGCACCTCACCAAATGTA-3’）/LMoV-R（5’-CATCATCTGCTGTATGCCTCT-3’），CMV-F（5’-CTTTGTAGGGAGTGAACGCTGTA-3’）/CMV-R（5’-AGATGGCGGCAACGGATA-3’），扩增产物的大小分别为198bp，395bp和248bp;
2.免疫捕获
1）取100mg复合感染LSV+LMoV+CMV的组织，加1mLPBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；
2）用pH9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV、LSV和CMV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV、LSV和CMV三种抗体的终浓度分别为1μg/mL、10μg/mL和50μg/mL；取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管，37℃孵育2h；
3）弃去包被液，用PBST洗3次，每次3min;加入200μL感病组织粗提液，37℃孵育3h；
4）弃去抗原液，用PBST洗3次，ddH2O洗1次，短暂离心，吸去残液；
3.三重RT-PCR
1)在包被过的PCR管中加入浓度均为10μmol/L的LSV、LMoV和CMV特异性反向引物LSV-R、LMoV-R和CMV-R各2μL,6μLddH2O，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2min；
2）三重RT：向上述PCR中按以下体系加入试剂，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15min，得到cDNAs混合物；
M-MLVbuffer（5×）4μL
dNTP混合物（各10mmol/L）2μL
RNase抑制剂（30U/μL）0.68μL
M-MLV反转录酶（200U/μL）0.70μL
DEPC-H2O0.62μL
3）三重PCR：取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行双重PCR：
10×PCRbuffer2.5μL
MgCl2（25mmol/L）2.5μL
dNTP混合物（各2.5mmol/L）2.5μL
LSV-F(10μmol/L）0.5μL
LSV-R(10μmol/L）0.5μL
LMoV-F(10μmol/L）0.5μL
LMoV-R(10μmol/L）0.5μL
CMV-F(10μmol/L）0.5μL
CMV-R(10μmol/L）0.5μL
TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.3μL
ddH2O12.2μL
三重PCR的反应条件为:94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃～58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30～35个循环，72℃延伸7min，降至常温；
4.电泳检测
三重PCR反应结束后取10μL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在1×TBE缓冲液环境中，100V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统并观察并记录结果；
5.结果分析
根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV、LMoV或CMV：
若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV；
若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV；
若凝胶中仅存在248bp的核酸片段则说明样品中含有CMV；
若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV；
若凝胶中同时存在198bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和CMV；
若凝胶中同时存在198bp、395bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV、LMoV和CMV。
依据上述方法，经检测兰州地区食用百合和切花百合样品上的LSV、LMoV和CMV，电泳检测结果中如含有198bp的片段，说明样品中含有百合隐症病毒；如含有395bp的片段，说明样品中含有百合斑驳病毒；如含有248bp的片段，说明样品中含有黄瓜花叶病毒。