技术领域：
本发明涉及一种用于分离环六肽的方法，并且涉及所得到的二乙酸卡泊芬净(caspofungindiacetate)的新晶形。
背景技术：
：环肽是其中的端胺基与端羧基形成内部肽键的多肽。几种环肽因其有益的药用特性而闻名。一个范例是作为有效抗真菌剂的棘白菌素(echinocandin)类。环肽可以是天然存在的化合物，但也可以通过全合成或通过天然存在或天然生产的前驱体的合成或基因改性而得到；后一类称为半合成的环肽。药用棘白菌素的例子是环六肽阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)、西洛芬净(cilofungin)和米卡芬净(micafungin)，它们可用于治疗真菌感染，特别是由曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、假丝酵母(Candida)、球孢子菌(Coccidioides)和组织胞浆菌(Histoplasma)引起的真菌感染。阿尼芬净(1-[(4R，5R)-4，5-二羟基-N2-[[4”-(戊氧基)[1，1’：4’，1”-四苯基]-4-基]羰基]-L-鸟氨酸]棘白菌素B；(1a)其中R1＝-OH，R2＝-C(O)-pC6H4-pC6H4-pC6H4-O(CH2)4CH3，R3＝-H，R4＝-CH3，R5＝-CH3)，卡泊芬净(1-[(4R，5S)-5-[(2-氨基乙基)氨基]-N2-(10，12-二甲基-1-肉豆蔻酰基)-4-羟基-L-鸟氨酸]-5-[(3R)-3-羟基-L-鸟氨酸]-纽莫康定B0；(1b)其中R1＝-NH(CH2)2NH2，R2＝-C(O)(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3，R3＝-H，R4＝-(CH2)2NH2，R5＝-H)和米卡芬净(1-[(4R，5R)-4，5-二羟基-N2-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-异噁唑基]苯甲酰基]-L-鸟氨酸]-4-[(4S)-4-羟基-4-[4-羟基-3-(硫代氧基)苯基]-L-苏氨酸]纽莫康定A0；(1c)其中R1＝-OH，R2＝-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-异噁唑基]苯甲酰基]-L-鸟氨酸]，R3＝-OSO3H，R4＝-CH2C(O)NH2，R5＝-CH3)都是衍生自天然存在的棘白菌素(例如棘白菌素B、纽莫康定A0或纽莫康定B0)的半合成环六肽。尽管大自然可以提供半合成环肽的复杂化学结构的实质性部分，但是在许多所有手性中心都要具有所需构型的情形中，主要的缺点为在发酵期间通常形成贯穿该方法的副产物，最终成为杂质。仅在很少数的例子中，可以按一定方式调控发酵过程以避免杂质的形成。特别是当这些杂质的结构与主要产物密切相关时，它们的除去通常很冗长并且通常需要没有先例的方法，因为所关注的主要产物是化学不稳定的和/或易于外消旋。例如，由发酵得到的纽莫康定B0(1，其中R1＝-OH，R2＝-C(O)(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3，R3＝-H，R4＝-CH2C(O)NH2且R5＝-H)来制备卡泊芬净是其中杂质的除去成为重要问题的方法。已描述了在纽莫康定B0的发酵中出现的多种结构相关的杂质。实例为：具有额外的甲基官能团的化合物(例如纽莫康定A0、纽莫康定A1、纽莫康定A2、纽莫康定A3、纽莫康定A4、纽莫康定A5、纽莫康定A6)，缺少一个或两个羟基的化合物(例如纽莫康定B1、纽莫康定B2、纽莫康定B5、纽莫康定B6、纽莫康定E0)，具有4-羟基脯氨酸而不是3-羟基脯氨酸片段的化合物(纽莫康定C0)，具有额外的羟基的化合物(例如纽莫康定D0、纽莫康定D2)或近来所述的杂质A(US2009/0324635)，其中在卡泊芬净结构中，羟基-L-鸟氨酸片段中的一个被L-丝氨酸片段代替。近年来，WO2010/008493中公开了一种用于制备氮杂环六肽盐的方法，其包括：喷雾干燥或通过加入无水有机溶剂来沉淀。尽管该方法产生高纯度的卡泊芬净，但沉淀也具有用于形成固体颗粒的已知方法的缺点(可能易于包含不希望的杂质)。鉴于严格的监管和健康相关的要求，但仍然需要不断改进的提纯和分离方法。发明详述第一方面，本发明公开了一种用于分离环六肽的方法，其包括下列步骤：(a)使包含环六肽和水的溶液与树脂接触；(b)从步骤(a)所得到的混合物中除去液相；(c)通过加入有机溶剂使其与在步骤(b)中除去水相之后所保留的材料接触，来洗提所述环六肽；(d)从步骤(c)所得到的混合物中分离出树脂；(e)使所述环六肽从除去所述树脂之后所保留的溶液中结晶；(f)从步骤(e)所得到的混合物中分离所述环六肽。分离之后，步骤(f)后所得到的环六肽可以被干燥，从而得到水含量降低的产物。额外的干燥过程的优点为：所得到的产物更易于处理，不易形成不想要的杂质，并且因而纯度更高。所述干燥可以通过本领域技术人员已知的过程来进行，例如加热、施加降低的压力、使气体流经过分离产物的上方或其组合。加热可以是温度范围从15℃到80℃，或从20℃到60℃，或从30℃到40℃。合适的气体是空气或惰性气体(例如氮气)或稀有气体(例如氩气、氦气、氖气或氙气)。特别地，所述环六肽是通式(1)的化合物。R1可以是-OR6或-NH(CH2)2NHR7，其中R6为-H或酰基、烷基、芳基、硫烷基或硫芳基(例如4-甲氧基苯硫基和苯硫基)并且R7为-H或酰基、烷基或芳基。R2可以为-H或C(O)R8，其中R8为-H或包含10-25个碳原子的基团，例如-pC6H4-pC6H4-pC6H4-O(CH2)4CH3、-(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3或-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-异噁唑基]苯甲酰基]-L-鸟氨酸]。R3可以是-OH或-H。R4可以是-CH3或-(CH2)2NHR7或-CH2C(O)NHR7，其中R7如上所述。R5可以为-CH3或-H。优选地，所述环六肽是阿尼芬净(1a；R1＝-OH，R2＝-C(O)-pC6H4-pC6H4-pC6H4-O(CH2)4CH3，R3＝-H，R4＝-CH3，R5＝-CH3)，卡泊芬净(1b；R1＝-NH(CH2)2NH2，R2＝-C(O)(CH2)8CH(CH3)CH2CH(CH3)CH2CH3，R3＝-H，R4＝-(CH2)2NH2，R5＝-H)，米卡芬净(1c；R1＝-OH，R2＝-[4-[5-[4-(戊氧基)苯基]-3-异噁唑基]苯甲酰基]-L-鸟氨酸]，R3＝-OSO3H，R4＝-CH2C(O)NH2，R5＝-CH3)等。上述环六肽可以通过下列本领域技术人员已知的方法来制备，例如全化学合成或半合成，即，发酵，随后进行一个或更多个化学转化。一个实例可以是如US5,552,521或US5,936,062中所述的使纽莫康定B0通过苯硫基纽莫康定B0胺转化为卡泊芬净。树脂可以是任何色谱材料，例如疏水相互作用的色谱材料、反相色谱材料、离子交换色谱材料或这些材料中两种或更多种的混合物。适用于本发明目的的树脂的实例为AmberchromXT30、AmberchromCG300S、AmberchromCG300sd、AmberchromCG300XT、AmberchromCG-71、AmberchromCG-161、Toyopearl’sButyl-650、Ether-650、Hexyl-650、Phenyl-650等。环六肽可以通过多种方式与树脂接触。这可以通过在容器中使环六肽的溶液(例如水溶液)与树脂结合来实现。可以搅拌所得到的混合物以改善吸附。随后树脂和/或液体的除去可以通过离心、过滤或沉淀或类似的技术来进行。或者，可以将该树脂填充到柱子中，并可以将该环六肽的溶液引到色谱柱上。在步骤(a)中使环六肽的溶液与树脂接触之后，可以洗涤树脂。该洗涤步骤将除去未被树脂吸附的杂质。可以用多种溶剂来进行洗涤，对于大多数环六肽来说，水或水和与水混溶的溶剂的混合物是优选的。在此方面，与水混溶的溶剂指的是在其中水的溶解度至少为5％(w/w)的溶剂。实例为醇类、酮类、乙腈等。具体而言，可以使用短链醇，其实例为乙醇、异丙醇、正丙醇和甲醇。洗涤步骤应该在洗提步骤(c)之前进行，可以在步骤(b)中的液体除去之前或之后进行。步骤(a)中使用的溶液也可以包含与水混溶的溶剂。步骤(c)中用于洗提的有机溶剂可以是与水混溶的有机溶剂。溶剂可以与水混合，例如乙醇/水的混合物，其中水的量为1-20％(w/w)或5-15％(w/w)。步骤(a)和(c)中使用的溶剂可以是相同的，但也可以是不同的。溶剂不同的好处在于，当需要从一种溶剂转换为另一种溶剂时，提供了高灵活性。第一溶剂可能优选用于合成目的，而另一种(即第二溶剂)可能优选用于结晶目的。本发明方法的一个优点在于，在应用该方法之前(即，在步骤(a)中)溶液中环六肽的浓度在所述方法的过程期间可能增大。因此，步骤(a)的溶液中所述环六肽的浓度可能比在步骤(d)中除去所述树脂之后所保留的溶液中所述环六肽的浓度低2到50倍。通常，浓度的增大对于随后的结晶步骤(e)和分离步骤(f)来说是有利的，因为母液中产物的损失降低。例如，步骤(a)中所述环六肽的浓度可能为0.1-5g.l-1，而在步骤(d)中除去所述树脂之后所保留的溶液中的所述环六肽的浓度可能为5-40g.l-1。后者浓度范围仍相对较低，因为尚未见到有关环六肽从溶度范围为5-40g.l-1的溶液中结晶的报导。本发明方法的另一个优点在于，分离(例如结晶)可以在步骤(d)之后进行，而没有中间浓缩步骤(中间浓缩步骤是现有技术中描述的方法)。很明显，本发明的方法避免了额外的工艺步骤，从而使得产量损失降低、杂质减少。另一个优点在于，在本发明方法期间，可以用另一种液体代替或部分代替其中溶解了环六肽的液体。这对于控制最终结晶产物的产量和纯度来说可能很有利。例如，步骤(a)的溶液中的水的量可以为75％-95％，而在步骤(d)中除去所述树脂之后所保留的溶液中的水的量可能小于10％，例如5％，或甚至小于0.5％。因此，本发明有利地提供了一种方法，通过该方法高度稀释的环六肽可以以良好的产率到高的产率分离。该方法简单，不需要昂贵和/或复杂的设备，并且不需要耗能的蒸发技术。此外，条件很温和，从而防止脆弱的环六肽发生不期望的降解。在适当的情况下，最终的环六肽可能以衍生自酸(例如乙酸、花生四烯酸、柠檬酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、苹果酸、草酸、棕榈酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、三氟乙酸)或碱(例如氢氧化钙、氢氧化钾和氢氧化钠)的药物可接受盐的形式。例如，可用于卡泊芬净(1b)的盐是二乙酸盐，可用于米卡芬净(1c)的盐是钠盐。第二方面，提供了二乙酸卡泊芬净的晶形，其通过选自由下列组成的组中的数据来表征：(a)XRD粉末衍射图，具有在2.92±0.2度、5.06±0.2度和5.88±0.2度的2θ角处的峰；(b)如图1所描绘的XRD粉末衍射图；(c)(a)和(b)的组合。值得注意的是，本发明的二乙酸卡泊芬净的晶形具有从第一方面的结晶方法中所得到的新颖形态。与WO2010/008493中公开的沉淀产物相比，明显的是，本发明的二乙酸卡泊芬净的晶形在2θ角为9.0±0.2度的区域没有显露出明显的峰。最强峰(2θ角为2.92±0.2度处)的强度与2θ角为9.0±0.2度的区域中任何峰的强度之比为至少10。在图1所示的样品中，所述比值为18。本发明的结晶的二乙酸卡泊芬净的水含量可以为0.1％-10％(w/w)。本发明的环六肽中水含量的范围的实例为0.1％-6％(w/w)，1％to8％(w/w)，2-6％(w/w)，或3.5％-5.5％(w/w)。通过HPLC测定，本发明的结晶的二乙酸卡泊芬净的纯度为至少99.0％。图1所示的样品的纯度为99.58％。经HPLC测定，杂质低于0.25％。通常，如图1所示的样品中所示，杂质为0.02％、0.04％、0.15％和0.19％。附图说明图1是化合物(1b)的XRD谱图。X-轴：2-θ值(度)。Y-轴：强度(cps).可以识别出3个明显的峰。峰的编号2-θ(deg)Flex宽度d-值强度I/Io12.9200.30630.231920,89810025.0600.32917.44992,7371435.8800.35315.01812,75114实施例综述X射线粉末衍射分析用来自Rigaku的UltimaIVX射线粉末衍射仪来分析样品。HPLC分析梯度：时间(min)0121522323440％A100848400100100％B0161610010000实施例1用苯硫基纽莫康定B0胺来制备粗制的二乙酸卡泊芬净将苯硫基纽莫康定B0胺的溶液(1.6L；17.3g苯硫基纽莫康定B0胺；15mmol；44vol％水)冷却到-10℃。搅拌下，在-10到-3℃的温度下在20分钟内加入乙二胺(EDA；320mL；4.7mol)。开始时立即形成白色沉淀，其随后溶解。反应混合物在21-22℃下搅拌15小时。在10-20℃下加入额外的EDA(170mL；2.5mol)，并在环境温度下继续搅拌31小时。搅拌下，将反应混合物和乙酸(1430mL；24.7mol)同时添加到1.5L预冷的0℃的水中，使温度保持低于10℃，并使pH保持为5.1-5.5(淬火是放热的)。在10℃和pH为5.3时，用庚烷(2x300mL)来萃取混合物。为了改善相分离，加入水(500mL)。合并庚烷相并用水(2x250mL)反萃取混合物。合并所有的水相，用水稀释至9.45L，以使乙醇含量降低至小于10％。将硅胶100C18(900g)悬浮在75％的乙腈(2L)中。将混合物放入柱(高度19.6cm；内径10cm)中。得到1540mL的床体积。首先用3个床体积的100％的乙腈来洗涤柱，然后在约1bar的压力下，用流速为80mL.min-1的3个柱床体积的0.15％的乙酸水溶液来平衡。按上述方法制备的卡泊芬净溶液(9.45L)原样用于加载在柱上。流速约为50mL.min-1。调整流速使压力保持低于5bar。线性流速约为0.6cm.min-1。加载容量为每L树脂10g二乙酸卡泊芬净(12g总卡泊芬净/L)。接着，用流速为70mL.min-1的0.15％的乙酸水溶液(3.2L)洗涤柱，之后用不同的溶剂组合物以相同的流速来洗提柱：-10％乙腈/0.15％乙酸(15L；9.7个床体积)-13％乙腈/0.15％乙酸(6375mL；4.1个床体积)-20％乙腈/0.15％乙酸(7125mL；4.6个床体积)通过用75％乙腈/0.15％乙酸(5625；3.7个柱床体积)洗涤使柱再生。用UV(280nm和254nm)连续监测洗出液，级分37-69被合并，得到产率为94.7％且二乙酸卡泊芬净的浓度为1.2g/l1.2g.L-1(基于产率和柱步骤之前的输入量)的12.4L的卡泊芬净溶液。所有级分中卡泊芬净的质量平衡为99.1％。实施例2二乙酸卡泊芬净的疏水相互作用的色谱和结晶用AmberchromXT30树脂填充直径为10cm的柱，得到628mL的床体积和8cm的床层高度。用0.15％的乙酸使柱平衡。依次进行两次加载、洗涤和洗提。用UV(280nm和254nm)连续监测洗出液。用0.15％的乙酸将实施例1中所制备的卡泊芬净溶液(12.4L)稀释至30L(＝进料)。加载1：卡泊芬净进料(21L)以80mL.min-1的流速向上流动加载在柱(16.7g卡泊芬净/L树脂)上。线性流速为1.0cm.min-1。压力不超过2.5bar。洗涤1：使0.15％的乙酸(1660mL)向下流动来洗涤柱。洗提1：使乙醇/0.15％乙酸(1000mL)向下流动来洗提柱。从UV信号开始增加的点(约1个床体积之后)开始收集200mL的级分，并通过HPLC进行分析，并Karl-Fischer分析进行水分析(表1)。表1柱第1轮运行的结果用0.15％的乙酸使柱平衡。加载2：卡泊芬净进料(10.345L)以70mL.min-1的流速向上流动加载在柱(8g卡泊芬净/L树脂)上。线性流速为0.9cm.min-1。压力不超过2.5bar。洗涤2：使0.15％的乙酸(947mL)向上流动来洗涤柱。洗提2：使乙醇/0.15％乙酸(735mL)向下流动来洗提柱。从UV信号开始增加的点(约1个床体积之后)开始收集级分，并通过HPLC进行分析，并Karl-Fischer分析进行水分析(表2)。表2柱第2轮运行的结果两次运行中1到5(包括)的级分被合并，得到估算浓度为9.5g.L-1(基于产率和两次运行之前的输入量)的1525mL的卡泊芬净溶液。两次运行中的总产率为96.2％。通过Karl-Fischer分析合并的级分的水浓度：5.5％.上面所得到的溶液(参见表3)原样用于结晶。表3浓缩和溶剂转换之后卡泊芬净溶液的HPLC结果于是，卡泊芬净溶液(1.48L；9.5g.L-1；12mmol)通过G4玻璃过滤器过滤，之后加入乙酸(5mL；87mmol)。在环境温度下，在约30分钟内缓慢加入乙酸乙酯(500mL)，使得温度降低至16℃。在约1小时内加入另一部分乙酸乙酯(500mL)，并再次滴加100mL的乙酸乙酯，连续搅拌30分钟。混合物稍微变得更混浊。再次滴加100mL的乙酸乙酯，并连续搅拌45分钟。最后，加入另一部分乙酸乙酯(50mL)，在20℃下使混合物搅拌45分钟。乙酸乙酯/乙醇(94.5％)的比例为1.2/1(v/v)。混合物是混浊的，并且明显形成晶体。为了增大产率，首先以0.69mL.min-1的连续流速在45分钟内加入30mL乙酸乙酯，然后以1.67mL.min-1的连续流速在约12小时内加入1220mL乙酸乙酯。乙酸乙酯/乙醇(94.5％)的最终比例为5/3(v/v)。过滤出晶体并用总计250mL的乙酸乙酯/乙醇/水(250/142/8，v/v/v)的混合物洗涤三次。湿的晶体(15.1g)在20℃下在真空中干燥9小时，得到12.3g晶体。这段时间之后，明显检测到乙醇的气味。因此，使氮气流经过晶体饼1小时，产生0.6g的重量损失。之后，晶体再干燥11小时，产生11.7g二乙酸卡泊芬净，为白色结晶性粉末(参见表4)，水含量为4.9％。表4结晶的二乙酸卡泊芬净的HPLC结果通过NMR按如下测定上面所得到的晶体中卡泊芬净、乙醇、乙酸乙酯和乙酸的含量。在适当的小瓶中精确称量约15mg的样品和标样(DMB)。通过涡流使样品溶于MeOD中。在300K下使用30s的延迟时间在600MHz下测量样品。使用5s的延迟时间和256次扫描(以增强信噪比)来测量用于计算芳族区域中杂质的谱图。分析进行两次。使用7.15ppm处的酪氨酸信号来量化卡泊芬净。结果请参见表5。表5结晶的二乙酸卡泊芬净的NMR结果％二乙酸卡泊芬净91.1(游离碱∶82.1)乙醇0.2乙酸8.8(2∶1乙酸∶卡泊芬净)乙酸乙酯＜0.2当前第1页1 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