一种高效获取DC细胞的方法与流程

本发明涉及医学免疫技术领域，尤其涉及一种高效获取DC细胞的方法。

背景技术：

DC-CIK生物免疫疗法(或DC+CIK)是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers,CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞，能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞(dendritic cell,DC)是有效的专职抗原提呈细胞，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。而在此技术中，需要分别培养DC细胞与CIK细胞，这两种细胞都是从PBMC中分离得到的，当前从PBMC中分离DC与CIK细胞的方法是通过半个小时的孵育，导致DC细胞获取数目不够多，从而影响后续的对CIK细胞的激活。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种高效获取DC细胞的方法，相对于现有技术中孵育0.5h，本发明采用孵育2h，使得DC细胞充分沉降，伸出伪足，贴壁到培养瓶的底部，实现与T淋巴细胞的完全分离。

本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法，包括如下步骤：

A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育1.5～2.5h；

B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基进行培养DC细胞。

其中采用的DC培养基型号为DC grow。

优选地，步骤A中，孵育的温度为37℃，孵育的环境为5％CO₂。

优选地，步骤A中，人外周血单个核细胞的制备方法如下：

S1、将人外周血注入离心管中进行一次离心得到物料a；

S2、去除上层血浆，然后取出中间的灰黄层，再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b；

S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层，接着进行二次离心，然后吸取白膜层得到物料c；

S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释，接着进行三次离心得到单个核细胞。

优选地，步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S1中，一次离心的离心速度为1450～1550rpm，一次离心的离心时间为14～16min。

优选地，步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S2中，灰黄层与物料b的体积比为2.5～5：35～40。

优选地，步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S3中，二次离心的离心速度为1550～1650rpm，二次离心的离心时间为18～22min。

优选地，步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S4中，三次离心的离心速度为1650～1750rpm，三次离心的离心时间为4～6min。

现有技术中往往采用将人外周血单个核细胞培育0.5h后，离心得到DC细胞，但本发明人发现人外周血单个核细胞培育0.5h的时候，DC细胞虽然大部分都沉降到培养瓶底部，但在将上清转移的时候，容易将DC细胞带走。

但是本发明人惊奇的发现，当培育0.5h后DC细胞会沉降到底部，并慢慢伸出伪足，而培育1.5h时，90％的DC细胞都紧紧贴在培养瓶底部，当培育2h时，DC细胞与培养瓶底部贴合力稳定，从而在转移上清和冲洗培养瓶底部的时候，DC细胞由于结合力比较大，不会脱落下来。从而提高DC细胞的获取数目，得到高纯度、高活性的DC细胞。

附图说明

图1为人外周血单个核细胞经本发明实施例5和现有技术孵育后DC细胞状态对比图；其中A为人外周血单个核细胞经现有技术孵育0.5h后DC细胞状态，B为人外周血单个核细胞本发明实施例5孵育2h后DC细胞状态。

图2为人外周血单个核细胞经孵育后收集到的DC细胞数目与孵育时间关系图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法，包括如下步骤：

A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育1.5h；

B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。

实施例2

本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法，包括如下步骤：

A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育2h，孵育的温度为37℃，孵育的环境为5％CO₂；

B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。

实施例3

本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法，包括如下步骤：

A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育2.5h，孵育的温度为37℃，孵育的环境为5％CO₂；

其中，人外周血单个核细胞的制备方法如下：

S1、将人外周血注入离心管中进行一次离心得到物料a；

S2、去除上层血浆，然后取出中间的灰黄层，再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b；

S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层，接着进行二次离心，然后吸取白膜层得到物料c；

S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释，接着进行三次离心得到单个核细胞。

B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。

实施例4

本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法，包括如下步骤：

A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育2.5h，孵育的温度为37℃，孵育的环境为5％CO₂；

其中，人外周血单个核细胞的制备方法如下：

S1、将人外周血注入离心管中进行一次离心得到物料a，一次离心的离心速度为1500rpm，一次离心的离心时间为15min；

S2、去除上层血浆，然后取出中间的灰黄层，再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b，灰黄层与物料b的体积比为2.5：40；

S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层，接着进行二次离心，然后吸取白膜层得到物料c，二次离心的离心速度为1600rpm，二次离心的离心时间为20min；

S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释，接着进行三次离心得到单个核细胞，三次离心的离心速度为1700rpm，三次离心的离心时间为5min；

B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。

实施例5

本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法，包括如下步骤：

A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中，转移至T175培养瓶，孵育2.5h，孵育的温度为37℃，孵育的环境为5％CO₂；

其中，人外周血单个核细胞的制备方法如下：

S1、将人外周血注入50mL离心管中进行一次离心得到物料a，一次离心的离心速度为1500rpm，一次离心的离心时间为15min；

S2、吸取上层血浆，分装3管5mL血浆，-20℃保存，剩余血浆56℃灭活30min，3000rpm/10min，去沉淀4℃保存；

然后取出中间的灰黄层，再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b，灰黄层与物料b的体积比为5：35；

S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层，接着进行二次离心，然后吸取白膜层得到物料c，二次离心的离心速度为1600rpm，二次离心的离心时间为20min；

S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释，接着进行三次离心得到单个核细胞，三次离心的离心速度为1700rpm，三次离心的离心时间为5min；

B、吸取不贴壁细胞加入已使用CD3/CD28抗体包被的T-175培养瓶中，加入1000U/ml IFNγ得到CIK细胞；然后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。

将实施例5和现有技术进行对比，如图1和图2所示。由图1和图2可知：孵育时间为2h，使得DC细胞充分沉降并贴壁到培养瓶的底部，实现与T淋巴细胞的完全分离，而孵育时间小于2h时DC细胞数量过少，孵育时间大于2h时的DC细胞数量相对于孵育时间为2h的DC细胞数量增长较少。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。