本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DC细胞负载抗原的方法。
背景技术：
树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞。DC细胞能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。成熟DC细胞可有效的诱导抗原特异性T细胞增殖和活化，是机体抗肿瘤免疫反应的主要启动者和参与者。故DC细胞被认为是充满前景的治疗工具。
DC细胞是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的DC细胞，当细胞数量达到一定数量后回输给病人，可诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应。但是，传统方法是在成熟DC细胞上负载抗原，该方法中成熟DC细胞负载抗原能力较低，成功负载抗原的DC细胞的分泌细胞因子的能力较弱，从而限制了DC细胞的应用。
技术实现要素：
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种DC细胞负载抗原的方法，本发明负载抗原能力好，所得负载抗原DC细胞分泌细胞因子的能力强。
本发明提出的一种DC细胞负载抗原的方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至36-38℃，孵育3.5-4.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，加入肽库得到溶液B；继续孵育23-25h得到负载抗原未成熟DC细胞溶液；
S3、取S2中得到的负载抗原未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液C；调节温度至36-38℃，孵育46-50h，收集细胞得到负载抗原DC细胞。
优选地，S1中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml。
优选地，S2中，在继续孵育，至有细胞集落生成的过程中，若培养基颜色变黄，则补加培养基。
优选地，S2中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml。
优选地，S2中，溶液B中，肽库的浓度为50μg/ml。
优选地，S3中，溶液C中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml。
上述S1中，DC-GROW培养基可以从市场上购得。
上述S2中，肽库为抗原，不规定其类型，根据具体操作选择具体类型，可以从市场上购得。
上述IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4均可从市场上购得。
本发明选择在未成熟DC细胞上负载抗原，未成熟DC细胞具有强烈的抗原吞噬和加工能力的性质，从而促进未成熟DC细胞可以很好的对抗原进行吞噬和加工，从而提高其对抗原的负载能力；进而增强负载抗原DC细胞的分泌细胞因子的能力。
附图说明
图1为本发明所得负载抗原DC细胞与DC细胞成熟后负载抗原所得负载抗原DC细胞的分泌细胞因子能力比较图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种DC细胞负载抗原的方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A，其中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至38℃，孵育3.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，加入肽库得到溶液B；继续孵育25h得到负载抗原未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液B中，肽库的浓度为50μg/ml；
S3、取S2中得到的负载抗原未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液C；调节温度至36℃，孵育50h，收集细胞得到负载抗原DC细胞，其中，溶液C中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml。
实施例2
一种DC细胞负载抗原的方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A，其中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至36℃，孵育4.5h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，加入肽库得到溶液B；继续孵育23h得到负载抗原未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液B中，肽库的浓度为50μg/ml；
S3、取S2中得到的负载抗原未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液C；调节温度至38℃，孵育46h，收集细胞得到负载抗原DC细胞，其中，溶液C中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml。
实施例3
一种DC细胞负载抗原的方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A，其中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至37.5℃，孵育3.8h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，加入肽库得到溶液B；继续孵育24.5h得到负载抗原未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液B中，肽库的浓度为50μg/ml；
S3、取S2中得到的负载抗原未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液C；调节温度至36.5℃，孵育49h，收集细胞得到负载抗原DC细胞，其中，溶液C中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml。
实施例4
一种DC细胞负载抗原的方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A，其中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至36.5℃，孵育4.2h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，加入肽库得到溶液B；继续孵育23.5h得到负载抗原未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液B中，肽库的浓度为50μg/ml；
S3、取S2中得到的负载抗原未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液C；调节温度至37.5℃，孵育47h，收集细胞得到负载抗原DC细胞，其中，溶液C中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml。
实施例5
一种DC细胞负载抗原的方法，包括如下步骤：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A，其中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至37℃，孵育4h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，加入肽库得到溶液B；继续孵育24h得到负载抗原未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，溶液B中，肽库的浓度为50μg/ml；
S3、取S2中得到的负载抗原未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液C；调节温度至7℃，孵育48h，收集细胞得到负载抗原DC细胞，其中，溶液C中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml。
试验例1
对照组负载抗原DC细胞的制备方法为：
S1、将人单核细胞加入DC-GROW培养基中混匀，培养得到溶液A，其中，溶液A中，人单核细胞的浓度为1×106个/ml；
S2、取S1中得到的溶液A，调节温度至37℃，孵育4h，除去非粘附细胞，向粘附细胞中加入培养基，继续孵育，至有细胞集落生成时，继续孵育24h得到未成熟DC细胞溶液，其中，培养基为含有IL-4、GM-CSF的DC-GROW培养基，其中，IL-4的浓度为1000U/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml；
S3、取S2中得到的未成熟DC细胞溶液，加入IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、GM-CSF、IL-4得到溶液B；调节温度至7℃，孵育48h，加入肽库得到溶液C；继续孵育24h收集细胞得到负载抗原DC细胞，其中，溶液B中，IL-1β的浓度为20ng/ml，IL-6的浓度为200ng/ml，TNF-α的浓度为20ng/ml，PGE2的浓度为2μg/ml，GM-CSF的浓度为800U/ml，IL-4的浓度为1000U/ml，溶液C中，肽库的浓度为50μg/ml。
对实施例5所得负载抗原DC细胞与对照组所得负载抗原DC细胞进行检测，测定其分泌细胞因子的浓度，检测结果参照图1，图1为本发明所得负载抗原DC细胞与DC细胞成熟后负载抗原所得负载抗原DC细胞的分泌细胞因子能力比较图。由图1可以看出，在DC细胞成熟前负载抗原所得负载抗原DC细胞分泌细胞因子的能力高于在DC细胞成熟后负载抗原所得负载抗原DC细胞。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。