一种检测人尿中cd80的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒，具体设及一种检测人尿中CD80的试剂盒。
【背景技术】
[0002] CD80,又称B7-1，是最早发现的共刺激分子，为I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超 家族成员，W单体的形式表达于B细胞及其他抗原提呈细胞(APC)的表面。T细胞的活化、增 殖、分化继而发挥其生物学效应至少需要双重信号的参与。第一信号是人类主要组织相容 性复合体(MHC)/抗原肤/T细胞受体(TCR)复合物，第二信号是非抗原依赖的共刺激信号 (Immunol Today，1994，15: 321-331)。后者由T细胞膜上表达的配体CD28与APC膜上表达的 共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)相结合而完成。CD80(B7-1)和CD86(B7-2)在T细胞活 化中的作用有何不同尚无定论，CD86常低水平表达于B细胞、巨隧细胞W及树突状细胞的表 面，抗原刺激后表达迅速上调，而CD80则为诱导性表达，生理状态下不表达或低表达，且抗 原刺激后表达上调速度慢，3-4天后表达才开始上调，因此CD86可能作用于免疫应答初期， 而CD80可能在免疫应答后期起一定的作用（Immunol Today，1999，20: 285-288; Curr Opin Cell Biol，1999，11:203-210;国际泌尿系统杂志，2013，33:282-285)。
[0003] 微小病变型肾病(Minimal Change Disease,MCD)是肾病综合征的常见类型，目 前，其诊断依赖于肾脏活检穿刺。MCD患者的尿中CD80的水平较其他肾小球疾病，包括局灶 节段性肾小球硬化(FSGS)、急性肾小球肾炎(AGN)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、IgA肾病、 膜性肾病(MN)，W及系统性红斑狼疮肾炎和正常对照均显著增高（J Am Soc Nephrol, 2009，20:260-266)。在MCD患者的肾脏活检组织中发现CD80仅表达于足细胞化idney Int， 2010,78:296-302)。因此，人尿中CD80(B7-1)含量的检测，可为肾脏病MCD的诊断和鉴别诊 断提供依据，有望改善肾活检穿刺依赖的微小病变肾病的诊断现状。
[0004] 通过国内专利检索，人尿中CD80 (B7-1)的检测尚无专利授权或申报。与CD80密切 相关的专利有:①抗人CD80双价抗体及其应用:所述双价抗体由重链可变区和轻链可变区 组成，其特征在于，两者间由连接肤Gly4Ser相连，此发明所述双价抗体与抗原的结合能力 强，对Raji细胞具有明显的抑制作用，可W用于肿瘤成像中，也可W应用在制备抑制肿瘤细 胞增殖的药物中。（申请号:CN201110056304;未授权;法律状态:发明专利申请公布后的视 为撤回）；②免疫性疾病的诊断方法:包括用例如识别CD80抗原的抗人CD80单克隆抗体对分 离自人的体液中淋己细胞和/或淋己细胞亚群的CD80抗原阳性率进行免疫学测定的步骤。 其特征在于:可对各种免疫疾病进行简便且准确的诊断，与W前的诊断方法相比，从患者中 可分离的外周血等体液中所含有的淋己细胞的操作简便，患者的负担小。而且还提供了含 有作为能减轻或预防免疫疾病的药物的特异性识别CD80抗原的人抗CD80抗原抗体（申请 号:CN201380047212;未授权;法律状态:公开）。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种新的灵敏度高、特 异性强的检测人尿中CD80的试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，所采取的技术方案:一种检测人尿中CD80的试剂盒，所述试剂盒 包括包被有抗人CD80抗体的固相载体、酶标记的另一抗人CD80抗体、CD80标准品、样品稀释 液、洗涂液和发光底物液。
[0007] 优选地，所述人尿为晨尿。其中24小时尿液或口诊随机尿次之。
[0008] 优选地，所述固相载体是由聚苯乙締制成的不透明微孔板。更优选地所述固相载 体是黑色或白色微孔板。
[0009] 优选地，所述包被有抗人CD80抗体的固相载体是由W下方法制备而成的：
[0010] 将抗人CD80抗体按照比例（抗人CD80抗体:包被液=2~lOyg: ImL)的量加入至包 被液中，得到含有抗人CD80抗体的包被液，其中所述包被液为抑=9.6、0.05M的碳酸盐;再 将所述含有抗人CD80抗体的包被液按10化L/孔加入至微孔板中，4°C放置24小时;去除包被 液后，按15化L/孔加入封闭液至微孔板中，37°C放置2~3小时，其中所述封闭液包括浓度为 O.Olmol/L、抑为7.2~7.4的口85(憐酸盐缓冲液），1%(讯八）的牛血清白蛋白，0.05%(乂八） 的proclin300和5%(w/v)的薦糖;甩掉封闭液，拍干微孔板，室溫除湿干燥24~72小时，锡 锥纸封袋，置2~8Γ保存。
[0011] 优选地，所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的二抗。所述二抗是与CD80结合的 检测抗体。
[0012] 优选地，所述酶标二抗是由W下方法制备而成：
[0013] 用戊二醒偶联法将二抗与辣根过氧化物酶偶联，再用酶标抗体稀释液稀释至工作 浓度，其中酶标抗体稀释液包括浓度为0.01~0. 〇5mol/L、pH为7.2~7.4的PBS，0.5% (w/v) 的牛血清白蛋白和0. l%(v/v)的proclinSOO。
[0014] 所述抗人CD80抗体和二抗，可W采用重组表达的人CD80免疫BALB/c小鼠，再经单 克隆筛选制备获得，或用商品化人CD80抗体。
[0015] 优选地，所述CD80标准品为CD80重组蛋白。
[0016] 优选地，所述样品稀释液包括浓度为0.01~0.2mol/L、pH为5.7~7.0的PBS。
[0017] 优选地，所述洗涂液包括浓度为0.01~0.2mol/L、pH为7.2~7.4的PBS，和体积浓 度为0.01%~0.05%(v/v)的TritonX-100。
[0018] 优选地，所述发光底物液包括发光底物A液和发光底物B液，所述发光底物A液包括 鲁米诺和异鲁米诺中的至少一种W及发光增强剂，所述发光底物B液包括过氧化氨和过氧 化脈中的至少一种W及稳定剂。优选地，所述发光底物A液和发光底物B液的体积比为1:1。
[0019] 本发明试剂盒的使用方法如下：
[0020] (1)试剂盒保存于2~8°C冰箱，使用前先将试剂盒平衡至室溫，平衡时间不少于30 分钟；
[0021] (2)将10化1待检的尿液标本和CD80系列标准品分别加入微孔板的不同板孔中，于 37 °C反应30分钟；
[0022] (3)用洗涂液洗涂板孔2~3次，每次静置3~5分钟，最后弃去洗涂液；
[0023] (4)将10化1辣根过氧化物酶标记的二抗加入步骤(3)洗涂后的板孔中，于37°C反 应30分钟；
[0024] (5)用洗涂液洗涂板孔2~3次，每次静置3~5分钟，最后弃去洗涂液；
[0025] (6)将发光底物A液和B液按1:1的体积混匀后，加入步骤(5)洗涂后的板孔中，再将 微孔板放入化学发光检测仪中，检测发光值；
[0026] (7)根据发光值与CD80标准品的浓度关系计算待检测的尿液中CD80的含量。
[0027] 本发明的有益效果在于:本发明的优点在于建立了一种仅适用于尿液中微量CD80 的灵敏、特异的定量检测试剂盒，不受尿液中其他成分的干扰。本发明试剂盒基于固相酶促 化学发光法，W包被抗人CD80抗体的微孔板为固相载体，用辣根过氧化物酶为催化酶催化 发光底物发光，显著提高了试剂的检测灵敏度。本发明为微小病变肾病的鉴别诊断提供了 一种检测手段，有助于改善肾活检穿刺依赖的微小病变肾病的诊断现状。
【附图说明】
[0028] 图1为采用本发明所述试剂盒检测微小病变肾病(MCD)患者、局灶节段性肾小球硬 化(FSGS)患者和狼疮肾炎患者尿液标本中CD80的含量结果。
【具体实施方式】
[0029] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0030] 实施例1
[0031] 一、检测人尿中CD80的试剂盒的制备
[0032] 1、抗人CD80抗体的固相载体的制备：
[0033] 将抗人CD80抗体按照比例（抗人CD80抗体:包被液=化g: ImL)的量加入至包被液 中，得到含有抗人CD80抗体的包被液，其中所述包被液为抑=9.6、0.05M的碳酸盐;再将所 述含有抗人CD80抗体的包被液按10化17孔加入至微孔板中，4°C放置24小时；去除包被液 后，按150μLν孔加入封闭液至微孔板中，37°C放置3小时，其中所述封闭液包括浓度为 O.Olmol/L、抑为 7.2 的 PBS，l%(w/v)的牛血清白蛋白，0.05%(v/v)的 proclin300 和 5%(w/ V)的薦糖;甩掉封闭液，拍干微孔板，室溫除湿干燥24小时，锡锥纸封袋，置2~8°C保存。
[0034] 2、酶标二抗的制备：
[0035] 用戊二醒偶联法将二抗与辣根过氧化物酶偶联，再用酶标抗体稀释液稀释至工作 浓度，其中酶标抗体稀释液包括浓度为0.0 lmol/L、抑为7.2的PBS，0.5% (w/v)的牛血清白 蛋白