一种软骨素合酶突变体及其应用的制作方法

技术特征：

1.一种软骨素合酶突变体，其特征在于，是(a)或(b)或(c)：

(a)在SEQ ID NO.2所示序列基础上，A²³⁶-P²⁴⁶区域的氨基酸序列突变为DILDCDMAPYA，D⁴⁶¹-D⁴⁷³区域的氨基酸序列突变为DLEVCTSEDGSPD，I⁶⁰⁰-Y⁶⁰⁹区域的氨基酸序列突变为MTNAVDYDVG；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有软骨素合酶活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有软骨素合酶活性的蛋白质。

2.编码权利要求1所述软骨素合酶突变体的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体或细胞。

4.一种获得权利要求1所述软骨素合酶突变体的方法，其特征在于，对大肠杆菌K4来源的软骨素合酶A²³⁶-P²⁴⁶，D⁴⁶¹-D⁴⁷³，G⁵¹⁶-E⁵³⁰和I⁶⁰⁰-Y⁶⁰⁹区域进行组合突变。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过对大肠杆菌K4来源的软骨素合酶的所述区域中非保守氨基酸进行组合突变，并在枯草芽孢杆菌中异源表达。

6.一种产软骨素的重组菌，其特征在于，重组表达权利要求1所述软骨素合酶突变体，并共表达SEQ ID NO.3所示半乳糖胺异构酶基因kfoA。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168为宿主，以诱导型启动子P_xylA启动编码软骨素合酶突变体的基因的表达。

8.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，以具有整合于Bacillus subtilis上lacA位点的上下游同源臂和红霉素抗性标记的pAX01为表达载体。

9.一种应用权利要求6-8任一所述重组菌发酵生产软骨素的方法，其特征在于，将所述基因工程菌接种至发酵培养基，在37℃下培养54-80h；所述发酵培养基：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸钾，1.5g/L硫酸镁，50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0。

10.权利要求1所述突变体及含有该突变体的细胞株系在生产软骨素中的应用。