本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科，单股负链闭合环状的DNA病毒，是目前所发现的最小的动物病毒。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原，据报道产生PMWS疾病猪群的死亡率高达5-30％。PCV2的感染会导致猪群免疫力下降，造成严重的免疫抑制。其和细小病毒、猪肺炎支原体、猪呼吸和繁殖综合症病毒等病原共同感染使猪群产生圆环病毒相关疾病(PCVAD)，给世界各个国家和地区的养猪产业造成巨大的经济损失。预防接种灭活疫苗是我国当前防控猪圆环病毒2型的主要手段。但由于当前的猪圆环病毒2型灭活疫苗制备工艺繁琐、价格昂贵，在一定程度上限制了疫苗的普及应用。针对PCV2基因工程疫苗的研究成为当前热点。
随着分子生物学技术的不断进步，新型基因工程疫苗的研发不断取得突破，其中基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗是研发热点之一，许多病原的免疫原性基因已经在新城疫载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、H5亚型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、严重急性呼吸综合征病毒的CoV蛋白、人类免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫(体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫)、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便(饮水、气雾、点眼/滴鼻等方式)、安全(毒株间发生重组及毒力返强可能性极小)等优点。但现有的新城疫病毒载体疫苗均是以非耐热型新城疫病毒为骨架构建的。
疫苗的免疫原性主要依靠抗原数量和抗原递呈效率。理论上来说，定位于细胞质的抗原能更有效地诱导免疫反应。组织型纤溶酶原激活因子信号序列(tPAs)是一个特异的蛋白分选信号，它直接把表达的抗原分选至内质网。与tPAs融合后，日本乙型脑炎病毒和牛病毒性腹泻病病毒的包膜蛋白在转染后的细胞中的表达水平显著高于野生型蛋白，且主要定位于细胞质和细胞膜上，可引发更强的体液免疫和细胞免疫。
现有已经上市的猪圆环病毒2型疫苗大多是将猪圆环病毒2型毒株经细胞增殖培养后灭活制备而成的，其主要原因是猪圆环病毒2型具有一定的致病性，不能用于制备活疫苗。此类灭活疫苗的缺点是制备工艺繁琐、需肌肉注射、费工费时、免疫成本高，在一定程度上限制了疫苗的普及应用。灭活疫苗的使用在一定程度上增加了临床上区分野毒感染与疫苗免疫的难度，且存在散毒风险。
王子龙等(河北农业大学，硕士毕业论文，2014年)公开了表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株。该疫苗株不具备显著的耐热特性，且未使用异源的信号肽(tPAs等)以增强其免疫原性。
因此，如何提供一种具有耐热、稳定性强、冷藏条件要求低的表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术中的不足，本发明进行了深入研究，提供了一种表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法。
本发明的一个目的在于提供1、表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株，其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-CAP/PCV，于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201626。
本发明另一方面还涉及上述表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1.1 信号肽替换的猪圆环病毒2型Cap基因的扩增
将猪圆环病毒2型HBZX株在PK-15细胞上进行增殖，接种5天后，反复冻融收获细胞培养液；将收获的细胞培养液进行Cap基因的PCR扩增，扩增引物为：5′-AGCGAAATCTCTTCAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC-3′；5′-TACCCGTATTTTTTCTTAATTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′，获得截短的Cap蛋白；以引物自延伸的方法扩增获得tPAs序列。将Cap和tPAs序列通过重叠PCR的方式进行连接，连接序列为AGCGAAATCTCTTCAAATGGCATCTTCAAC，再进行PCR扩增，扩增引物为：上游引物5′-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAG-3′，下游引物5′-TACCCGTATTTTTTCTTAATTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′；对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接；
1.2 新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5′-GAAAAAATACGGGTAGAATCGGAGTGCCCCGATTGTG-3′，下游引物5′-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGC-3′；扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C；对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接。
1.3 重组质粒pTS-Cap/PCV的克隆连接
采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的Cap基因片段和耐热载体片段进行克隆连接，连接序列分别为CAGCTATATTAAGGA和GAAAAAATACGGGTA；连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养，对菌液进行Cap基因的PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液进行质粒提取；
1.4 重组病毒rTS-Cap/PCV的拯救恢复
采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-Cap/PCV与三个分别表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞；转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚；接种后5天，收获鸡胚尿囊液，分离得到表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株。
本发明另一方面还涉及上述表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备重组病毒中的应用。
本发明另一方面还涉及上述表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备H5禽流感、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。
本申请公开了一种可表达信号肽替换的猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组新城疫病毒耐热株并将其用于制备猪圆环病毒2型亚单位耐热活疫苗。该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省保存运输成本和提高疫苗热稳定性。该疫苗株表达的是信号肽序列被tPAs替换的截短Cap蛋白，tPAs可针对性地增强Cap蛋白的表达分泌及免疫反应。
附图说明
图1本发明表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组耐热新城疫病毒全长质粒的构建示意图。其中rTS09-C为亲本株的基因组结构，rTS-Cap/PCV为在rTS09-C基因组中插入了Cap蛋白后的结构，详细标注了插入序列的整体序列组成。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均在本发明的保护范围内。
实施例1
第一步、重组全长质粒pTS-Cap/PCV的构建与鉴定
1.1 信号肽替换的猪圆环病毒2型Cap基因的扩增
将猪圆环病毒2型HBZX株(该病毒株已有文章报道，温国元，等，猪圆环病毒2型HBZX株的全基因组克隆及序列分析，湖北省农业科学，2008)在PK-15细胞上进行增殖，接种5天后，反复冻融收获细胞培养液。将收获的细胞培养液进行Cap基因的PCR扩增(扩增引物为：5′-AGCGAAATCTCTTCAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC-3′；5′-TACCCGTATTTTTTCTTAATTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′)，获得截短的Cap蛋白(删除信号肽)。以引物自延伸的方法扩增获得tPAs序列。将Cap和tPAs序列通过重叠PCR的方式进行连接(连接序列为AGCGAAATCTCTTCAAATGGCATCTTCAAC)，再进行PCR扩增，扩增引物为：上游引物5′-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAG-3′，下游引物5′-TACCCGTATTTTTTCTTAATTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约0.7kb，与预期的730bp相符(删除自身信号肽的Cap基因长度为579bp，分别在Cap基因前端和后端引入了基因起始序列和基因终止序列，同时在Cap基因前端引入了Kozak序列和tPAs序列)。对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后，测定DNA浓度，待进行克隆连接。
1.2 新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增
以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列，扩增引物为：上游引物5′-GAAAAAATACGGGTAGAATCGGAGTGCCCCGATTGTG-3′，下游引物5′-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGC-3′(下划线部分为用于In-fusion克隆连接的互补序列)。扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C(该质粒已有文献报道，商雨，新城疫病毒TS09-C株全长cDNA克隆的构建及荧光定量RT-PCR检测方法的建立，硕士毕业论文，华中农业大学，2012)。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带约18kb，与预期的17.8kb大小相符。对PCR产物进行回收纯化，测定其浓度，待克隆连接。
1.3 重组质粒pTS-Cap/PCV的克隆连接
按照图1所示的方式，采用In-fusion克隆连接技术，将纯化好的Cap基因片段和耐热载体片段进行克隆连接(连接序列分别为CAGCTATATTAAGGA和GAAAAAATACGGGTA)。连接产物转化DH5α感受态细胞，转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养。对菌液进行Cap基因的PCR鉴定。鉴定为阳性的菌液进行质粒提取，待酶切和测序鉴定。
1.4 重组质粒pTS-Cap/PCV的酶切与测序鉴定
分别以BamHI和MluI内切酶对全长重组质粒进行酶切鉴定，均得到了与预期相符的酶切图谱。将酶切鉴定正确的重组质粒pTS-Cap/PCV送至测序公司进行序列测定，结果表明猪圆环病毒2型Cap基因插入到了新城疫病毒耐热载体的P和M基因之间，tPAs序列成功替换了Cap蛋白自身的信号肽序列，且所有序列与预期完全一致，重组质粒pTS-Cap/PCV构建成功。
第二步、重组病毒rTS-Cap/PCV拯救恢复与鉴定
2.1 重组病毒rTS-Cap/PCV的拯救恢复
采用脂质体转染法，将已构建的重组质粒pTS-Cap/PCV与三个分别表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞(已预感染表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒)。转染后72小时，反复冻融收获细胞液，接种9-11日龄SPF鸡胚。接种后5天，收获鸡胚尿囊液，待进行新城疫病毒检测。
2.2 重组病毒的血凝效价和荧光定量PCR检测
以血凝试验和荧光定量PCR的方法，对收获鸡胚尿囊液进行检测，结果均为新城疫阳性。初步表明重组病毒rTS-Cap/PCV拯救成功。
2.3 重组病毒Cap基因的PCR扩增与测序
应用猪圆环病毒2型Cap基因的特异性扩增引物(扩增引物为5′-AATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC-3′；5′-TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′)，对重组病毒rTS-Cap/PCV的Cap基因进行RT-PCR扩增，对PCR扩增产物进行序列测定分析，得到730bp长的Cap基因序列(SEQ ID No.1)，从5′到3′端，依次包含了P基因的部分非编码区序列(UTR)、P基因的基因终止序列(GE)、中间序列(IG)、Cap基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、tPAs序列、Cap基因序列(删除了自身信号肽)、Cap基因的双重终止密码子、Cap基因的GE序列、IG序列、M基因的GS序列和M基因的UTR序列。与预期序列100％一致。
第三步、信号肽替换的猪圆环病毒2型截短Cap蛋白在重组病毒rTS-Cap/PCV中的表达验证
3.1 间接免疫荧光法检测信号肽替换的Cap蛋白的表达
将重组病毒rTS-Cap/PCV和rTS09-C(对照)分别以0.01MOI感染BHK-21细胞，24h后进行间接免疫荧光检测，一抗为NDV阳性鸡血清或H5亚型禽流感阳性血清。检测结果表明，重组病毒rTS-Cap/PCV感染的细胞内，使用NDV阳性鸡血清或猪圆环病毒2型阳性血清作为一抗时均能检测到绿色荧光，而rTS09-C株感染的细胞只在NDV阳性血清作用下检测到荧光。
3.2 Western Blot法检测信号肽替换的Cap蛋白的表达
将重组病毒rTS-Cap/PCV和rTS09-C(对照)分别以0.01MOI感染BHK-21细胞，24h后收集细胞裂解液，以猪圆环病毒2型阳性血清为一抗进行Western Blot检测。检测结果表明，在25KDa附近出现一条明显的目的条带，与预期的25.06KDa大小相近。表明信号肽替换的Cap蛋白在重组病毒感染的细胞内正确表达。
第四步、重组病毒rTS-Cap/PCV的生物学特性鉴定(由2.1得到该重组病毒，2.2至3.2均是验证病毒的特性)
4.1 重组病毒的增殖特性测定
为比较重组病毒rTS-Cap/PCV株与亲本rTS09-C株的生长增殖情况，将两株病毒分别以100TCID50接种BHK-21细胞，接种后24h、48h、72h、96h取上清500μl，测定病毒TCID50，绘制病毒的生长曲线。结果表明，重组病毒rTS-Cap/PCV株和亲本rTS09-C株在BHK-21细胞的生长曲线相似，增殖滴度相近，约为107.0TCID50/ml。
4.2 重组病毒的致病性测定
测定重组病毒对鸡胚的最小致死剂量的平均致死时间(MDT/MLD)，结果显示不同稀释度(10-1至10-9)的病毒接种鸡胚后的120h内均不会对鸡胚致死，重组病毒rTS-Cap/PCV的MDT/MLD大于120h，表明重组病毒保持了亲本株的低毒特性，外源基因的插入并未改变重组病毒的致病性。
4.3 重组病毒的耐热特性测定
测定重组病毒在56℃环境下的HA耐热特性，同时设置非耐热株LaSota株和耐热株rTS09-C株为对照。如表1所示，非耐热株LaSota在56℃耐热处理9min后，HA效价降为0，亲本株rTS09-C和重组病毒rTS-Cap/PCV在56℃耐热处理150min后仍具有血凝活性。表明重组病毒rTS-Cap/PCV的耐热特性与亲本株一致，均为耐热株。(该病毒株已经保藏，保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:V201626)
表1.重组病毒的HA耐热特性测定结果
a表示病毒具有血凝活性，b表示病毒没有血凝活性
以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡是根据本发明内容的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。
序列表
<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法
<160>1
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<213> OrganismName :
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cagctatatt aaggattaag aaaaaatacg ggtagaaagc ttgccaccat ggatgcaatg 60
aagagagggc tctgctgtgt gctgctgctg tgtggagcag tcttcgtttc gcccagcgaa 120
atctcttcaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca ccttcggata tactatcaag 180
cgaaccacag tcaaaacgcc ctcctgggcg gtggacatga tgagattcaa tattaatgac 240
tttcttcccc caggaggggg ctcaaacccc cgctctgtgc cctttgaata ctacagaata 300
agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tccccgatca cccagggtga caggggagtg 360
ggctccagtg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa aggccacagc cctcacctat 420
gacccctatg taaactactc ctcccgccat accataaccc agcccttctc ctaccactcc 480
cgctacttta cccccaaacc tgtcctagat tccactattg attacttcca accaaacaac 540
aaaagaaatc agctgtggct gagactacaa actactggaa atgtagacca cgtaggcctc 600
ggcactgcgt tcgaaaacag tatatacgac caggaataca atatccgtgt aaccatgtat 660
gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccactta acccttaata attaagaaaa 720
aatacgggta 730
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