表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株及制备方法与流程

文档序号:12457236阅读:来源:国知局

技术特征:

1.表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株,其特征在于所述的耐热疫苗株分类命名为rTS-VP2/CPV,于2016年4月19日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:V201626。

2.表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株的制备方法,其特征在于包括如下步骤:

1.1信号肽替换的猪圆环病毒2型Cap基因的扩增

将猪圆环病毒2型HBZX株在PK-15细胞上进行增殖,接种5天后,反复冻融收获细胞培养液;将收获的细胞培养液进行Cap基因的PCR扩增,扩增引物为:5′-AGCGAAATCTCTTCAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC-3′;5′-TACCCGTATTTTTTCTTAATTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′,获得截短的Cap蛋白;以引物自延伸的方法扩增获得tPAs序列,将Cap和tPAs序列通过重叠PCR的方式进行连接,连接序列为AGCGAAATCTCTTCAAATGGCATCTTCAAC,再进行PCR扩增,扩增引物为:上游引物5′-CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAG-3′,下游引物5′-TACCCGTATTTTTTCTTAATTATTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3′;对PCR产物进行琼脂糖凝胶回收纯化后,测定DNA浓度,待进行克隆连接;

1.2新城疫病毒耐热载体片段的PCR扩增

以超长片段PCR的方法获得新城疫病毒载体序列,扩增引物为:上游引物5′-GAAAAAATACGGGTAGAATCGGAGTGCCCCGATTGTG-3′,下游引物5′-TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGC-3′;扩增模板为新城疫病毒耐热株质粒pTS09-C;对PCR产物进行回收纯化,测定其浓度,待克隆连接;

1.3重组质粒pTS-Cap/PCV的克隆连接

采用In-fusion克隆连接技术,将纯化好的Cap基因片段和耐热载体片段进行克隆连接,连接序列分别为CAGCTATATTAAGGA和GAAAAAATACGGGTA;连接产物转化DH5α感受态细胞,转化后的细胞在LB平皿上培养16小时后挑单菌落进行液体培养,对菌液进行Cap基因的PCR鉴定,鉴定为阳性的菌液进行质粒提取;

1.4重组病毒rTS-Cap/PCV的拯救恢复

采用脂质体转染法,将已构建的重组质粒pTS-Cap/PCV与三个分别表达NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞;转染后72小时,反复冻融收获细胞液,接种9-11日龄SPF鸡胚;接 种后5天,收获鸡胚尿囊液,分离得到表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株。

3.权利要求1所述的表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备重组病毒中的应用。

4.权利要求1所述的表达猪圆环病毒2型截短Cap蛋白的重组新城疫耐热疫苗株在制备H5禽流感、新城疫二联耐热活疫苗中的应用。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1