一种羊依诺肝素钠及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种羊来源的低分子肝素——羊依诺肝素钠，及其制备方法与应用，属于医药生物
技术领域：
，也属于清真药物。
背景技术：
：依诺肝素钠(EnoxaparinSodium，ES)是一种低分子的肝素钠盐，由大分子肝素经解聚而来，是目前临床上应用最广泛的抗凝抗栓药物之一。目前USP39和EP8.6规定依诺肝素钠的来源为猪肠粘膜肝素，而猪肝素不具有清真性。清真是穆斯林在中国流行的专用名称，穆斯林教义对食品和药品等有着明确的要求，哺乳动物中只允许食用牛、绵羊、山羊等反刍动物产品，禁食猪和狗等不反刍动物产品。全球穆斯林人口2013年突破16亿，占全球69亿人口的23％。在一些由穆斯林人口占多数的国家，如印度尼西亚、巴基斯坦、伊朗等等，清真市场缺失符合清真教义的抗凝药物，开发符合穆斯林教义的清真低分子肝素有着无可比拟的优势。本发明人在之前的专利申请(申请公布号：CN105131153A)中，详细描述了一种羊依诺肝素钠的制备方法，这种羊依诺肝素钠是本发明人首次报道的不同于猪来源依诺肝素钠的化合物，本发明将着重介绍此羊依诺肝素及其注射剂，包括其具体的理化性质和生物学性质研究。技术实现要素：本发明目的在于提供一种羊依诺肝素钠及其制备方法与应用。本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：羊依诺肝素钠，是以羊源的肝素制备得到的。所述羊依诺肝素钠的二糖组成，以肝素酶酶解后的SAX-HPLC分析，主要二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量在60％-74％之间，含量次多的二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)分别是8％-11％和4％-7％，与抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至关重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰——ΔⅡA-ⅡSglu，含量是1.2％-2.1％；而在猪肠粘膜依诺肝素钠中，ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS的含量分别是58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％，ΔⅡA-ⅡSglu的含量则是2.1％-2.5％。所述羊依诺肝素钠包括绵羊来源的依诺肝素钠和山羊来源的依诺肝素钠。所述绵羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为66％-74％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为8％-10％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为4％-6％；所述山羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为60％-68％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为9％-11％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为5％-7％。进一步地，绵羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为66.26％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为9.15％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为6.44％；山羊来源的依诺肝素钠的二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)含量为63.58％，二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)含量为10.71％，二糖ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)含量为10.27％。所述羊依诺肝素钠的化学结构，以核磁共振氢谱和核磁共振碳谱来判断，羊依诺肝素钠与猪依诺肝素钠的谱图大致相同，但氢谱δ2.04ppm和碳谱δ24.9ppm共同反映的氮-乙酰基的甲基峰，羊依诺肝素钠中积分要小一些，反映出糖链上氮-乙酰基修饰更少。所述的核磁共振方法，更优的方案是采用异核单量子关系-核磁共振(HSQC-NMR)等更高级的二维核磁分析，以此可以明确判断一些具体糖链结构上的差异。所述羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例分析，方法遵照USP37进行，磺酸根羧酸根比例反映糖链上的磺酸根修饰情况，羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例在2.0以上，USP37和EP8.0规定的猪肠粘膜依诺肝素钠的放行标准中，该项指标是不小于1.8，羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例稍高，反映出羊依诺肝素钠的磺酸化修饰程度更高。所述羊依诺肝素钠的生物学抗凝活性，参照USP37进行分析，抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在20-35单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.8-4.8之间。其中抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性都与USP37和EP8.0规定的依诺肝素钠放行标准一致，但抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例要稍小一些，在USP37和EP8.0中，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在3.3-5.3之间。优选地，所述羊依诺肝素钠可进行精制和分级，使抗-Ⅹa活性和抗-Ⅱa活性及两者之间的比例，符合USP37对依诺肝素钠的放行标准。所述羊依诺肝素钠的分子量及分子量分布，参照USP37进行分析，羊依诺肝素钠的重均分子量在3800-5000之间，其中分子量<2000部分的比例在12.0％-20.0％之间，2000<分子量<8000部分的比例在68.0％-82.0％之间，分子量>8000部分的比例不超过18.0％。羊依诺肝素钠的分子量及分子量分布，符合USP39和EP8.6规定的依诺肝素钠放行标准要求。所述羊依诺肝素钠的1,6-酐含量测定，具体是利用肝素酶酶解后进行强阴离子交换树脂-高效液相色谱(SAX-HPLC)分析检测，酶解和检测方法遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行。所述羊依诺肝素钠的1,6-酐含量在15％-25％之间，符合USP37和EP8.0规定的依诺肝素钠放行标准要求。优选地，所述羊依诺肝素钠可进行精制或分级。羊依诺肝素钠的精制包括脱色、反复的盐水复溶醇沉等方式，分级则包括阴离子交换分级或超滤分级，以使羊依诺肝素钠产品的指标符合USP37和EP8.0规定的除种源外依诺肝素钠放行标准要求，包括提高抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例以及其他指标，对比现行的药典版本USP39和EP8.6也是完全符合的。优选地，所述羊依诺肝素钠在防治与抗凝、抗栓有关疾病中的应用，以及开发为清真抗凝抗栓药物。以上所述羊依诺肝素钠的制备方法，与本发明人在之前的专利申请(申请公布号：CN105131153A)主张的制备方法相同，具体采用如下步骤：S1、原料羊肝素的预处理：将羊肝素钠粗品溶解后进行溶液脱色，精过滤，再在室温下进行醇沉精制，收集沉淀物，干燥获得羊肝素；S2、羊肝素季铵盐的制备：将S1中获得的羊肝素溶解配制成羊肝素水溶液，并与苄索氯铵水溶液进行混合，过滤或离心获得羊肝素季铵盐，并进行洗涤干燥，制得羊肝素季铵盐；S3、羊肝素苄酯的制备：将S2中干燥得到的羊肝素季铵盐与有机溶剂二氯甲烷及氯化苄按重量比例混合酯化，在酯化后的羊肝素季铵盐中滴加醋酸钠甲醇溶液，制得羊肝素苄基酯沉淀，将羊肝素苄基酯沉淀进行过滤、洗涤、干燥，制得羊肝素苄基酯；S4、羊依诺肝素钠成品制得：将S3中的羊肝素苄基酯进行碱解聚，脱色，以酸中和至中性，醇沉淀，精制，干燥，得到羊依诺肝素钠成品。优选地，S1中采用质量浓度为1％-3％的氯化钠水溶液溶解羊肝素钠粗品进行脱色、过滤和精制，直至预处理后羊肝素钠的水溶液澄清且色度不深于5号标准色；醇沉精制的沉淀剂为甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮中的一种或几种的组合。S2中苄索氯铵与羊肝素钠的重量比为2-5:1。S3中酯化温度30-40℃，羊肝素季铵盐、二氯甲烷、氯化苄的质量比为1:3-10:1.1。S4中采用氢氧化钠溶液解聚，解聚温度在30℃-70℃之间，保温时间在0.5小时以上；S4中采用双氧水脱色，室温或以下加入0.1-1倍羊肝素苄基酯重量的30％双氧水，氧化脱色10分钟以上，直至反应液颜色浅至Y6与GY6以下。优选地，S3中羊肝素苄基酯沉淀的洗涤包括如下步骤：S31、在加入醋酸钠甲醇溶液的羊肝素季铵盐溶液中加入甲醇静置沉降和分离制得羊肝素苄基酯；S32、在分离后的羊肝素苄基酯中添加8％-12％的氯化钠水溶液进行复溶，所述氯化钠水溶液与所述羊肝素季铵盐重量比为0.5-2:1；S33、对S32中获得的溶液以60％-70％的甲醇终浓度进行醇沉结晶；S34、重复氯化钠水溶液复溶和醇沉结晶2-5次至羊肝素苄基酯复溶不浑浊。一种羊依诺肝素钠注射剂，组分包括以上所述的羊依诺肝素钠和注射用水。优选地，所述羊依诺肝素钠注射剂的制备方法，是将羊依诺肝素钠以注射用水溶解，待完全溶解后补注射用水至一定的浓度，无菌过滤，灌装至注射器、西林瓶或安瓿瓶等。优选地，所述羊依诺肝素钠注射剂的活性浓度在10000抗-Ⅹa单位每毫升，优选制成预灌封针，规格为4000抗-Ⅹa单位、6000抗-Ⅹa单位和10000抗-Ⅹa单位以及其他规格。优选地，所述羊依诺肝素钠注射剂，在抗凝、抗栓及清真药物中的应用。另一种羊依诺肝素钠注射剂，组分包括羊依诺肝素钠、注射用水和苯甲醇。优选地，所述另一种羊依诺肝素钠注射剂的制备方法，是将羊依诺肝素钠以注射用水溶解，再加入苯甲醇，待完全溶解混匀后补注射用水至一定的浓度，无菌过滤，灌装至西林瓶等。优选地，所述苯甲醇的浓度在1.35毫克每毫升至1.65毫克每毫升之间。优选地，所述另一种羊依诺肝素钠注射剂的活性浓度在10000抗-Ⅹa单位每毫升，优选灌封成西林瓶，规格为30000抗-Ⅹa单位以及其他规格。优选地，所述另一种羊依诺肝素钠注射剂，在抗凝、抗栓及清真药物中的应用。优选地，所述羊依诺肝素钠和羊依诺肝素钠注射剂的抗凝作用，体外试验以人血考察。血液分离血浆后，按自动凝血仪和试剂盒方法，考察羊依诺肝素钠和羊依诺肝素钠注射剂等对血凝常规的影响，包括但不限于APTT、TT和PT等。优选地，所述羊依诺肝素钠和羊依诺肝素钠注射剂的抗凝作用，体内试验优选兔进行动物体内试验。优选皮下注射给药后，采集给药前及给药后各时间点的兔血液，用3.8％枸橼酸钠抗凝剂1:9抗凝，上机检测对血凝常规的影响，包括但不限于APTT、TT和PT等，以及其他凝血因子的影响。优选地，所述羊依诺肝素钠和羊依诺肝素钠注射剂，在体内外抗凝试验，均表现出近似或等同于依诺肝素钠标准品的效果。本发明突出效果为：提供了一种羊依诺肝素钠以及它的注射剂，除了由种源特征性带来的分子结构(二糖组成)和抗凝血活性(较小的抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例)外，羊依诺肝素钠均符合其他USP37依诺肝素钠所列的质量放行指标，对比现行的USP39和EP8.6，也是符合的。羊依诺肝素钠，原料简便易得，质量可控，可极大丰富市场中依诺肝素钠的来源和产量。羊依诺肝素钠来源于羊，具有清真性，属于清真药物，可应用于广大穆斯林国家、地区和人群，经济潜力巨大。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。附图说明图1为本发明实施例1所述羊依诺肝素钠样品与依诺肝素钠标准品的二糖谱比较示意图。图2为本发明实施例2所述羊依诺肝素钠样品与依诺肝素钠标准品的1H-NMR对比示意图。图3为本发明实施例3所述羊依诺肝素钠样品与依诺肝素钠标准品的13C-NMR比较示意图。图4为本发明实施例4所述羊依诺肝素钠样品的磺酸根和羧酸根比例示意图。图5为本发明实施例6所述羊依诺肝素钠样品与依诺肝素钠标准品的分子量分布比较示意图图6为本发明实施例10所述羊依诺肝素钠及其注射剂样品与依诺肝素钠标准品在兔体内对APTT、PT和TT的影响以及抗-Ⅹa活性比较示意图，其中(1)为对APTT的影响图，(2)为对PT的影响图，(3)为对TT的影响图，(4)为抗-Ⅹa活性图。具体实施方式本发明实施例描述了一种羊来源的依诺肝素钠——羊依诺肝素钠，以及羊依诺肝素钠注射剂，下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。羊依诺肝素钠成品，来源于本发明人专利申请(申请公布号：CN105131153A)的实施例二，以下实施例如无特殊说明，均采用此样品或类似工艺制备的分级后样品。实施例1羊依诺肝素钠二糖和1,6-酐含量分析：二糖组成和1,6-酐含量分析，遵照USP32附录<207>“依诺肝素钠的1,6-酐衍生物检查”进行，结果见图1和表1。表1：羊依诺肝素钠与依诺肝素钠标准品的二糖组成比例及1,6-酐％从图1和表1可以看出，羊依诺肝素钠与依诺肝素钠标准品的二糖相比，ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS的含量分别是70.2％、9.19％和5.01％，ΔⅡA-ⅡSglu的含量则是1.60％，这些都与依诺肝素钠标准品有差异。同时，羊依诺肝素钠的1,6-酐百分含量与标准品几乎相同，为20.4％，符合USP37要求的15％-25％的指标。实施例2羊依诺肝素钠的核磁氢谱(1H-NMR)分析：羊依诺肝素钠的核磁氢谱分析，设备用苏州大学分析测试中心的400MHz核磁共振谱仪，以3-三甲基硅基丙酸钠-d4(TSP)定零点。待测样品溶液配制：羊依诺肝素钠样品和依诺肝素钠标准品，各准确各称取20毫克左右，按重以氘水(D2O)溶解成20毫克每毫升左右的浓度，滴加1-2滴TSP，震荡混匀后0.22微米过滤送检，结果如图2所示，其中，3.4ppm为甲醇残留的甲基氢峰，4.7ppm为水氢峰。结果显示，羊依诺肝素钠样品的氢谱与依诺肝素钠标准品基本一致，但在δ2.04ppm处的氮-乙酰基的甲基峰，羊依诺肝素钠样品的积分含量要低一些，说明羊依诺肝素钠样品中，氮-乙酰基修饰更少，相应地，其氮-磺酸基修饰就更多。通常，更多的磺酸基修饰可以带来更高的抗凝活性。实施例3羊依诺肝素钠的核磁碳谱(13C-NMR)分析：羊依诺肝素钠样品的的核磁碳谱分析，设备用苏州大学分析测试中心的400MHz核磁共振谱仪，方法遵照USP37进行。结果如图3所示，其中，50ppm为甲醇残留的甲基碳峰。结果显示，同氢谱一致，羊依诺肝素钠样品的碳骨架与依诺肝素钠标准品一致，但一些具体的位置，如24.9ppm的氮-乙酰基的甲基碳，含量有一定的差异。USP37没有对氮-乙酰基积分的要求，因此，羊依诺肝素钠样品的碳谱是符合药典规定的。实施例4羊依诺肝素钠的磺酸根羧酸根比例分析：磺酸根羧酸根比例的分析方法遵照USP37进行，以活化过的阳离子树脂和阴离子树脂分别装柱串联，装柱规格分别是1.5厘米×7.5厘米和1.5厘米×2.5厘米。准确称取羊依诺肝素钠样品50毫克，以纯水配制成5毫克每毫升，上样依次通过装有阴离子树脂和阳离子树脂的柱子，在柱子出口端用烧杯收集流出液。流出液以氢氧化钠溶液进行滴定，并记录电导率的变化。参照USP37进行作图，计算磺酸根和羧酸根的摩尔比，结果如图4所示。从图4可以看出，羊依诺肝素钠样品的磺酸根和羧酸根比例是2.4，USP37规定的依诺肝素钠放行标准是不小于1.8，通常猪依诺肝素钠的磺酸根和羧酸根比例是2.2，羊依诺肝素钠要稍大一些，这反映出羊依诺肝素钠有更多的磺酸化修饰。实施例5抗-Ⅹa、抗-Ⅱa活力和全绵羊血浆法活力对比分析：抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性测定遵照USP37进行，全绵羊血浆法的抗凝血活性参照专利申请(申请公布号：CN105131153A)的实施例进行，羊依诺肝素钠样品与依诺肝素钠标准品的各活性对比如下表2。表2：羊依诺肝素钠样品的抗凝活力对比结果显示：羊依诺肝素钠样品和依诺肝素钠标准品相比，全绵羊血浆法的抗凝血活力相当，在各药典规定的抗-Ⅹa和抗-Ⅱa的活性及比例方面，羊依诺肝素钠样品符合USP37的放行指标要求。实施例6重均分子量及分子量分布分析：分子量及分子量分布分析与计算参照USP37方法进行，结果如附图5和表3所列。表3：羊依诺肝素钠样品的重均分子量及分子量分布结果可以看出，羊依诺肝素钠样品(Ovine-038)，其均重分子量和分子量分布与依诺肝素钠标准品非常接近，符合USP37放行指标的要求。实施例7羊依诺肝素钠注射剂1的制备：按活性计算并准确称取羊依诺肝素钠粉末190.6克(干燥失重3.4％，折干后105.6抗-Ⅹa单位每毫克，共0.2亿抗-Ⅹa单位)，以冷却的注射用水溶解并定容至2000毫升，两级0.2微米过滤器无菌过滤进A级洁净区，并以灌封机灌封至1毫升玻璃注射器中，规格为6000单位(或0.6毫升)，去除损耗，共收获羊依诺肝素钠注射剂1成品2160支。实施例8羊依诺肝素钠注射剂2的制备：按活性计算并准确称取羊依诺肝素钠粉末190.6克(干燥失重3.4％，折干后105.6抗-Ⅹa单位每毫克，共0.2亿抗-Ⅹa单位)，以冷却的注射用水溶解，加入75.0克苯甲醇，搅拌均匀，再以冷却的注射用水定容至2000毫升，两级0.2微米过滤器无菌过滤进A级洁净区，并以灌封机灌封至5毫升西林瓶中，规格为30000单位(或3.0毫升)，去除损耗，共收获羊依诺肝素钠注射剂2成品552瓶。实施例9羊依诺肝素钠与羊依诺肝素钠注射剂的人血体外抗凝试验：实验方法：每次采用3人份外周静脉血3mL，用3.8％枸橼酸钠抗凝剂1:9抗凝，3000转/分离心5分钟，分离出贫血小板血浆(PPP)。按试剂盒方法，上机(全自动血凝仪，StagoCompact)检测。实验组别如下：羊依诺肝素钠样品组(批号：Ovine-038)、羊依诺肝素钠注射剂1组(实施例七所述)、羊依诺肝素钠注射剂2组(实施例八所述)和依诺肝素钠标准品组(为临床市售药品，克赛，批号：24459)，其浓度均为～3μg/mL，实验设生理盐水为空白对照。结果与分析：1)APTT、PT和TT实验结果如下表格所示：表4体外对APTT、PT和TT的影响组别APTTPTTT羊依诺肝素钠样品104.1±9.5s13.2±0.6s127.4±37.4s羊依诺肝素钠注射剂1105.3±12.1s13.9±0.4s145.4±43.6s羊依诺肝素钠注射剂2102.5±9.8s13.4±0.5s134.4±44.3s依诺肝素钠104.8±10.2s13.8±0.3s140.4±54.7s空白对照38.1±1.4s12.7±0.6s16.6±0.7s由表4可知，在体外所有样品组别均可以显著延长APTT和TT，但对PT的影响较小。2)AT和纤维蛋白原：实验结果如下表格所示：表5体外对AT和纤维蛋白原的影响组别AT纤维蛋白原复钙时间羊依诺肝素钠样品2.31±0.34g/L96.33±10.50s31.00±0.00s*羊依诺肝素钠注射剂12.26±0.34g/L97.00±9.54s31.00±0.00s*羊依诺肝素钠注射剂22.24±0.37g/L96.67±9.50s31.00±0.00s*依诺肝素钠2.29±0.44g/L99.00±6.29s31.00±0.00s*空白对照2.57±0.25g/L94.00±8.1s9.95±0.40s*：均已超出检测范围由表5可知，与依诺肝素钠标准品相比，羊依诺肝素钠及其注射剂对AT和纤维蛋白原均几乎无影响；在体外所有样品均可以显著延长复钙时间，数据均已超出检测范围(>31.00s)。所有以上数据揭示，羊依诺肝素钠及其注射剂，在体外有着良好的抗凝效果，且与依诺肝素钠标准品相当。实施例10羊依诺肝素钠与羊依诺肝素钠注射剂的动物体内抗凝试验：实验方法：选取日本大白兔2-3Kg，根据体重分别在前背部近上肢处皮下注射给药。试验组别设置如下：羊依诺肝素钠样品组(批号：Ovine-038)、羊依诺肝素钠注射剂1组(实施例七所述)、羊依诺肝素钠注射剂2组(实施例八所述)和依诺肝素钠标准品组(为临床市售药品，克赛，批号：24459)，浓度均为1mg/Kg；实验设生理盐水为空白对照。于给药前及给药后30min、1h、2h、4h、6h和8h分别采血3mL，用3.8％枸橼酸钠抗凝剂1:9抗凝，上机检测(同1.1体外抗凝血实验)以及抗-Ⅹa活性。实验结果与分析：1)APTT：实验结果如附图6(1)所示，从图中可以看出：与依诺肝素钠标准品相比，羊依诺肝素钠及其注射剂均能显著延长APTT，且其对APTT延长作用相当，他们在兔体内达到APTT最大值时间相近，衰减时间也相近，揭示羊依诺肝素钠及其注射剂在兔体内与依诺肝素钠标准品是一致的。2)PT：实验结果如附图6(2)所示，从图中可以看出：各组样品在兔体内均对PT影响较小。此外，在前述1.2中，这三者在体外对PT无显著延长，体内外的效应呈现出相对的一致性。3)TT：实验结果如附图6(3)所示，从图中可以看出：羊依诺肝素钠及其注射剂均能显著延长TT，在兔体内达到TT最大值的时间与依诺肝素钠标准品相近，衰减时间也相当。4)抗-Xa活性：实验结果如附图6(4)所示，从图中可以看出：各组皮下注射后，兔血浆中肝素的抗-Ⅹa活性，其吸收和代谢(或衰减)曲线均一致，都是在大约2小时至4小时达到吸收峰值，在8小时几乎全部衰减。所有以上数据揭示，羊依诺肝素钠及其注射剂，在兔体内有着良好的抗凝效果，且与依诺肝素钠标准品相当。本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3