本发明属于生物技术领域，具体涉及一种壳聚糖的制备方法。
背景技术：
壳聚糖又名脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素和聚氨基葡萄糖，其化学名称为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，系甲壳素用浓碱处理后脱去乙酰基而得到的产物。
甲壳素又名几丁质、甲壳质等，是许多低等动物特别是节肢动物如虾、蟹、昆虫等外壳的重要成分(约含10-30％)，也存在于低等植物如菌藻类和真菌的细胞壁中，它是由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖的基本单元经β(1→4)糖苷键连接的天然高分子聚合物，是迄今为止唯一发现的阳离子动物纤维和唯一的碱性多糖。甲壳素及其衍生物具有许多独特的功能和特性，在环保、食品、医药、制作功能材料、农林业、轻纺工业等领域得到了广泛应用，具有巨大的经济价值和广阔的应刚前景，随着甲壳素及其衍生物化学研究的不断深入，甲壳素产业将会在本世纪得到蓬勃发展。
目前甲壳素的来源主要为虾、蟹壳和昆虫甲壳，其中昆虫甲壳中甲壳素含量较高，钙和重金属含量低，杂质少，纯度高，质量好，提取过程中对水、酸、碱消耗少，生产成本低，因此，昆虫甲壳素要优于虾、蟹甲壳素。
中国专利CN102321192A提供了一种蝇蛆壳聚糖制备方法，将蝇蛆外壳采用盐酸搅拌浸泡离心后，取沉淀物物加入氢氧化钠水溶液中去除废物，再经脱色得到粗制蝇蛆甲壳素，再经微波加热法脱去乙酰基得到壳聚糖。该法所制壳聚糖的脱乙酰率较高，但由于壳聚糖的制备中使用了大量的浓碱，使得壳聚糖的分子链大量断裂，降低了其分子量和纯度，限制了产品的应用范围。
技术实现要素：
本发明提供了一种壳聚糖的制备方法，操作简便、设备常规，所得壳聚糖的分子量高、纯度高、脱乙酰度高。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为：
一种壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：
(1) 除钙：将昆虫甲壳粉碎后，置于质量浓度为10-20%的稀酸中于30-50℃浸煮4-6小时，过滤，取滤饼水洗3-5次后干燥得脱钙产物A待用，昆虫外壳中含有大量的钙质，利用稀酸将其溶解去除，将原料进一步分解。
(2) 脱蛋白：将脱钙产物A、复合酶和水置于反应容器中，控制反应液PH为7.5-8.5，于40-55℃搅拌水解2-3小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得脱蛋白产物B待用；所述复合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性脂肪酶的混合物，三者的质量比为1：1：2。利用复合酶将滤饼A中的蛋白质酶解并溶于水中，反应条件温和，采用该配方的复合酶对昆虫甲壳中蛋白质的酶解效率更高，酶解效果更好。相比于氢氧化钠脱蛋白能获得高质量的甲壳素，且不会造成甲壳素的分子链断裂，从而降低其分子量。
(3) 纯化：将脱蛋白产物B置于混合溶剂中，并加入中性盐，于60-80℃搅拌溶解1-3小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除中性盐，干燥得所需甲壳素；所述混合溶剂为己酸、乙二酸和吡啶的混合物，三者的质量比为1：0.8：0.5。将滤饼B经混合溶剂溶解再浓缩得到高纯度高分子量的甲壳素产品。甲壳素大分子中具有稳定的环状结构和大分子之间存在强的氢键作用，使它的溶解性能变差，不溶于水、稀酸、稀碱和一般的有机溶剂中。甲壳素在浓硫酸、盐酸、硝酸和85％磷酸等强酸中可溶解，但与此同时会发生剧烈的降解，使相对分子质量明显降低。本发明所采用的己酸、乙二酸和吡啶的混合溶剂，对甲壳素溶解率高，同时不会降低其分子量。加入中性盐是为了增加反应液的离子强度，利用甲壳素的阳离子特性，增强其在混合溶剂中的溶解率。
(4) 脱乙酰：将步骤(3)所得甲壳素和15-20%NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于紫外光下照射2-3小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于50-60℃干燥24小时后得壳聚糖。通常使用浓碱脱乙酰基，在获得高的脱乙酰率同时，甲壳素的主链降解严重，从而降低了壳聚糖的分子质量，影响了产品质量。本发明采用浓度较低的稀碱，通过超声-紫外联合的方式，脱除乙酰基，在获得高脱乙酰度的同时，减少了甲壳素主链降解，保证了壳聚糖产品质量。
作为优选，步骤(1)中所述稀酸为盐酸、硫酸或磷酸。
作为优选，步骤(1)中所述稀酸质量为昆虫甲壳质量的20-30倍。
作为优选，步骤(2)中所述脱钙产物A、复合酶和水的质量比为1：0.05-0.08：10-30。
作为优选，步骤(3)中所述脱蛋白产物B、混合溶剂和中性盐的质量比为1：15-20：0.1-0.3。
作为优选，所述中性盐为NaCl、KCl、Na2SO4、MgCl2或MgSO4。
作为优选，步骤(4)中所述甲壳素与NaOH水溶液质量比为1：8-15。
本发明的有益效果为：
1、采用复合酶水解昆虫外壳中的蛋白质和脂肪，水解条件温和，酶解效率高，且不会降低甲壳素分子量。
2、采用己酸、乙二酸和吡啶组合的混合溶剂和中性盐协同溶解甲壳素，对甲壳素溶解率高，有助于提高甲壳素回收率和纯度，同时不会降低其分子量。
3、采用浓度较低的稀碱，通过超声-紫外联合的方式，脱除乙酰基，在获得高脱乙酰度的同时，减少了甲壳素主链降解，保证了壳聚糖产品质量。
4、本发明的壳聚糖制备工艺简单，设备常规，酸碱废水产量低，符合绿色环保生产的要求。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
实施例1
(1) 除钙：将10g昆虫甲壳粉碎后，置于200g质量浓度为10%的稀酸中于50℃浸煮4小时，过滤，取滤饼水洗3-5次干燥后得7.2g脱钙产物A；
(2) 脱蛋白：将7.2g脱钙产物A、0.09g胰蛋白酶、0.09g木瓜蛋白酶、0.18g碱性脂肪酶和144g水置于三口烧瓶中，控制反应液PH为7.5，于40℃搅拌水解3小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得4.3g脱蛋白产物B；
(3) 纯化：将4.3g脱蛋白产物B、28g己酸、22g乙二酸、14g吡啶和0.43gNaCl中，于60℃搅拌溶解3小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除NaCl，干燥得3.2g甲壳素，HPLC纯度为92.3%，回收率为29.54%，灰分为0.8%。
(4) 脱乙酰：将3g甲壳素和45g 15%NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于245nm紫外光下照射2小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于50℃干燥24小时后得2.4g壳聚糖，其脱乙酰度为95.2%，纯度为97.3%，粘度为165cp。
注：壳聚糖粘度的测定方法为：取0.5g壳聚糖溶于100ml 0.5%醋酸中，室温下用旋转粘度计测定，壳聚糖粘度越高，则其分子量越大。
实施例2
(1) 除钙：将10g昆虫甲壳粉碎后，置于250g质量浓度为15%的稀酸中于30℃浸煮6小时，过滤，取滤饼水洗3-5次干燥后得7.8g脱钙产物A；
(2) 脱蛋白：将7.8g脱钙产物A、0.12g胰蛋白酶、0.12g木瓜蛋白酶、0.24g碱性脂肪酶和78g水置于三口烧瓶中，控制反应液PH为8，于50℃搅拌水解2.5小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得5.1g脱蛋白产物B；
(3) 纯化：将5.1g脱蛋白产物B、40g己酸、32g乙二酸、20g吡啶和1g MgSO4中，于70℃搅拌溶解2小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除MgSO4，干燥得3.8g甲壳素，HPLC纯度为93.8%，回收率为35.6%，灰分为0.78%。
(4) 脱乙酰：将3g甲壳素和30g 18%NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于245nm紫外光下照射2.5小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于55℃干燥24小时后得2.7g壳聚糖，其脱乙酰度为94.8%，纯度为96.3%，粘度为158cp。
实施例3
(1) 除钙：将10g昆虫甲壳粉碎后，置于300g质量浓度为20%的稀酸中于40℃浸煮5小时，过滤，取滤饼水洗3-5次干燥后得6.9g脱钙产物A；
(2) 脱蛋白：将6.9g脱钙产物A、0.14g胰蛋白酶、0.14g木瓜蛋白酶、0.28g碱性脂肪酶和水置于三口烧瓶中，控制反应液PH为8.5，于55℃搅拌水解2小时后，过滤，取滤饼水洗干燥得4.6g脱蛋白产物B；
(3) 纯化：将4.6g脱蛋白产物B、40g己酸、32g乙二酸、20g吡啶和1.4g Na2SO4中，于80℃搅拌溶解1小时后，过滤，滤液经减压干燥去除溶剂，再经水洗去除Na2SO4，干燥得3.5g甲壳素，HPLC纯度为93.1%，回收率为32.6%，灰分为0.72%。
(4) 脱乙酰：将3g甲壳素和24g 20%NaOH水溶液加入石英玻璃反应容器中，置于245nm紫外光下照射3小时，同时予以超声处理，反应结束后降温至室温，离心，沉淀物水洗至中性，于60℃干燥24小时后得2.2g壳聚糖，其脱乙酰度为93.6%，纯度为96.8%，粘度为153cp。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。