一种具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针及其制备方法。

背景技术：

荧光探针是以荧光物质作为指示剂，并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光，通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。当前，荧光探针主要应用于生物、医学和环境监测等领域，针对不同的需求，相应的探针已被大量的探究，总体来说，可以分为三类：传统的荧光探针、无机量子点探针、新型的荧光探针。其中，传统的荧光探针有光不稳定性、光漂白以及聚集诱导淬灭效应等缺陷，而无机量子点探针因其含有重金属而具有不可忽视的细胞毒性问题，因此新型荧光探针脱颖而出。而具有聚集诱导发光(AIE)特性的探针因其卓越的荧光性能备受关注。羧化壳聚糖(NCS)是壳聚糖部分糖环被羧化后的产物，具有优异的生物相容性、生物活性、无毒性、体内循环长滞留性、广泛pH范围内可水溶等性能，在生物医学领域备受青睐。因此，考虑到现在生物医学研究中对细胞长周期示踪(如研究癌症的发展、诊断、治疗；免疫反应以及转移后的干细胞基因完整性、增值、分化等)以及广泛pH范围内使用(如癌症患者细胞外pH_e介于5.7至7.8之间)的荧光探针的迫切需求，制备一种广泛pH范围内可水溶且具有长周期细胞示踪性能的荧光探针具有重要的科学意义和良好的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种广泛pH范围内可水溶且具有长周期细胞示踪性能的具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针及其制备方法。

本发明的具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)将粘均分子量为1万-100万、乙酰度5％-20％、羧化度20％-60％的羧化壳聚糖分散于DMSO中，在50-65℃下溶胀12-48h，再向该溶液中加入含异硫氰酸酯官能团的TPE分子(TPEITC)，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为1％-20％，反应24-48h，获得溶液A；

2)向溶液A中加入四氢呋喃，四氢呋喃与溶液A的体积比为10，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心，所得沉淀物用适量无水乙醇超声分散20min，离心，将沉淀用三蒸水溶解，得到溶液B；

3)将溶液B装入截留分子量为3500的透析袋中并置于三蒸水中透析4-5天，冻干，获得荧光标记的羧化壳聚糖(TPE-NCS)；

4)将步骤3)的荧光标记羧化壳聚糖溶于体积分数为1％的醋酸溶液中，得到荧光标记羧化壳聚糖溶液C；

5)配制质量分数为1-40％的多聚磷酸钠溶液，将多聚磷酸钠溶液以溶质质量比为1：5的比例滴加入溶液C，即：使得多聚磷酸钠与TPE-NCS质量比为1:5，剧烈搅拌0.5-1h，离心，去除上清液，加入适量三蒸水，获得具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针。

本发明通过将四苯基乙烯(TPE)荧光分子标记到羧化壳聚糖链上得到具有AIE特性的TPE-NCS，再利用多聚磷酸钠将TPE-NCS进行离子交联，从而制得具有聚集诱导发光特性且水溶液中分散均匀的纳米荧光探针(TPE-NCS NP_s)。本发明得到的TPE-NCS分子式如图1所示，多聚磷酸根结构式如图2所示，产物TPE-NCS NP_s的TEM如图3所示。

产物被标记上的TPE基团赋予其聚集诱导发光特性，与传统荧光探针及无机量子点探针相比，具有灵敏度高，光稳定性好，荧光光谱不漂移，生物相容性好等优点。而羧化壳聚糖是两亲性分子，羧化度介于20％-60％之间时在稀酸溶液、中性水溶液及稀碱溶液中可溶，且因富含氨基、羧基基团，具有良好的生物活性，可实现生物体内长循环、长滞留的功效。此外，离子交联后的TPE-NCS NP_s纳米粒子尺寸均一，易于细胞胞吞，且便于存储。总之，本方法制备的TPE-NCS NP_s纳米荧光探针具有广泛pH可溶、可长循环示踪及聚集诱导发光等优良特性，有望应用于细胞长周期示踪、药物代谢检测、病理监测等领域。

附图说明

图1是羧化壳聚糖基聚集诱导发光荧光分子结构式。

图2是交联剂多聚磷酸根分子结构式。

图3是羧化壳聚糖基聚集诱导发光纳米荧光探针TEM图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实例进一步说明本发明。

实施例1：

1)称取1g羧化壳聚糖(粘均分子量为1万，乙酰度为20％，羧化度20％)加入到茄形瓶中，分散于10mL DMSO，50℃下溶胀12h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为1％，反应24h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；

2)向溶液A中加入100mL四氢呋喃，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心，所得沉淀物用20mL无水乙醇溶解并超声分散20min，离心，将沉淀用5mL三蒸水溶解，得到溶液B；

3)将溶液B装入截留分子量为3500的透析袋中并置于三蒸水中透析4天，冻干，获得荧光标记的羧化壳聚糖TPE-NCS；4)称取0.5g TPE-NCS溶于10mL体积分数为1％的醋酸溶液，得到50mg/mL的荧光标记羧化壳聚糖溶液C；

5)配制质量分数为1％的多聚磷酸钠溶液，将多聚磷酸钠溶液以溶质质量比为1：5的比例滴加入溶液C中，剧烈搅拌0.5h，离心，去除上清液，加入10mL三蒸水获得具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针。

本例制得的TPE-NCS荧光探针TPE标记率为0.71％。

实施例2：

1)称取1g羧化壳聚糖(粘均分子量为5万，乙酰度为15％，羧化度30％)加入到茄形瓶中，分散于10mL DMSO，50℃下溶胀12h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为5％，反应24h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；

2)向溶液A中加入100mL四氢呋喃，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心，所得沉淀物用20mL无水乙醇溶解并超声分散20min，离心，将沉淀用5mL三蒸水溶解，得到溶液B；

3)将溶液B装入截留分子量为3500的透析袋中并置于三蒸水中透析4天，冻干，获得荧光标记的羧化壳聚糖TPE-NCS；

4)称取0.5g TPE-NCS溶于10mL体积分数为1％的醋酸溶液，得到50mg/mL的荧光标记羧化壳聚糖溶液C；

5)配制质量分数为5％的多聚磷酸钠溶液，将多聚磷酸钠溶液以溶质质量比为1：5的比例滴加入溶液C中，剧烈搅拌0.5h，离心，去除上清液，加入10mL三蒸水获得具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针。

本例制得的TPE-NCS荧光探针TPE标记率为1.35％。

实施例3：

1)称取1g羧化壳聚糖(粘均分子量为20万，乙酰度为10％，羧化度35％)加入到茄形瓶中，分散于10mL DMSO，50℃下溶胀24h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为10％，反应36h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；

2)向溶液A中加入100mL四氢呋喃，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心，所得沉淀物用20mL无水乙醇溶解并超声分散20min，离心，将沉淀用5mL三蒸水溶解，得到溶液B；

3)将溶液B装入截留分子量为3500的透析袋中并置于三蒸水中透析4天，冻干，获得荧光标记的羧化壳聚糖TPE-NCS；

4)称取0.5g TPE-NCS溶于10mL体积分数为1％的醋酸溶液，得到50mg/mL的荧光标记羧化壳聚糖溶液C；

5)配制质量分数为10％的多聚磷酸钠溶液，将多聚磷酸钠溶液以溶质质量比为1：5的比例滴加入溶液C中，剧烈搅拌1h，离心，去除上清液，加入10mL三蒸水获得具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针。

本例制得的TPE-NCS荧光探针TPE标记率为3.58％。

实施例4：

1)称取1g羧化壳聚糖(粘均分子量为50万，乙酰度为10％，羧化度40％)加入到茄形瓶中，分散于10mL DMSO，50℃下溶胀36h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为15％，反应36h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；

2)向溶液A中加入100mL四氢呋喃，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心，所得沉淀物用20mL无水乙醇溶解并超声分散20min，离心，将沉淀用5mL三蒸水溶解，得到溶液B；

3)将溶液B装入截留分子量为3500的透析袋中并置于三蒸水中透析5天，冻干，获得荧光标记的羧化壳聚糖TPE-NCS；

4)称取0.5g TPE-NCS溶于10mL体积分数为1％的醋酸溶液，得到50mg/mL的荧光标记羧化壳聚糖溶液C；

5)配制质量分数为20％的多聚磷酸钠溶液，将多聚磷酸钠溶液以溶质质量比为1：5的比例滴加入溶液C中，剧烈搅拌1h，离心，去除上清液，加入10mL三蒸水获得具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针。

本例制得的TPE-NCS荧光探针TPE标记率为9.31％。

实施例5：

1)称取1g羧化壳聚糖(粘均分子量为100万，乙酰度为5％，羧化度60％)加入到茄形瓶中，分散于10mL DMSO，50℃下溶胀48h，然后向茄形瓶中加入TPEITC，TPEITC与壳聚糖中氨基的摩尔比为20％，反应48h，获得溶液A并将其倒入250mL烧杯中；

2)向溶液A中加入100mL四氢呋喃，搅拌均匀后静置至溶液分层，去除上清液，离心，所得沉淀物用20mL无水乙醇溶解并超声分散20min，离心，将沉淀用5mL三蒸水溶解，得到溶液B；

3)将溶液B装入截留分子量为3500的透析袋中并置于三蒸水中透析4天，冻干，获得荧光标记的羧化壳聚糖TPE-NCS；

4)称取0.5g TPE-NCS溶于10mL体积分数为1％的醋酸溶液，得到50mg/mL的荧光标记羧化壳聚糖溶液C；

5)配制质量分数为40％的多聚磷酸钠溶液，将多聚磷酸钠溶液以溶质质量比为1：5的比例滴加入溶液C中，剧烈搅拌1h，离心，去除上清液，加入10mL三蒸水获得具有聚集诱导发光特性的羧化壳聚糖纳米荧光探针。

本例制得的TPE-NCS荧光探针TPE标记率为12.01％。