本发明涉及天然药用植物马比木的深加工领域，尤其涉及一种利用微生物发酵技术从马比木中提取高纯度药用植物单体喜树碱的方法。
背景技术：
传统的喜树碱(camptothecin)生产是从中国特有的珙桐科植物喜树中提取出来的。然而喜树碱在喜树中含量低，根皮中含量为万分之四，果实中含量为万分之七，枝叶中含量极少，天然提取时其生产成本高、产量低，且植物资源有限。因此，寻找替代资源以及对其综合利用，是解决喜树碱资源瓶颈的关键。
本发明以马比木为原料，利用微生物发酵技术进行高纯度药用植物单体喜树碱的生产方法的研究。马比木，学名：nothapadytesfoetida(wight)sleum茶茱萸科icacinaceae，小灌木。原产地：台湾兰屿。在印度有少量分布。在此之前，有关的专家和学制者均认为在中国大陆没有该物种。但从在2008年3月开始，经过恩施市锦华生物工程有限责任公司科研人员几个月的实地调查，发现该物种在武陵山区(恩施自治州、湘西自治州、重庆部分山区等地)有大面积生长。经过前期试验研究，发现马比木的各个部位(根、茎、叶、果实)富含抗癌成分喜树碱(camptothecin)，喜树碱的平均含量是喜树果的4倍以上。研究还发现马比木的嫩叶和嫩枝中喜树碱含量较高，而且生长迅速，可以大面积规模化种植，不必大量砍伐树木，通过采集嫩叶和嫩枝就可持续不断的获得喜树碱生产的原料资源。
喜树碱及其衍生物是重要抗肿瘤药物，具有独特的dna拓扑异构酶i抑制能力，通过稳定topi—dna可裂解复合物而发挥抗肿瘤作用。临床上喜树碱及其衍生物具有显著的抗肿瘤、抗白血病活性、抗病毒和治疗皮肤病等方面的作用。主要用于消化系统癌症：胃癌、食道癌、结肠癌、直肠癌、肝癌及恶性胸、腹腔积液等的治疗；对口腔、颈面部癌、头颈部癌、头颈部圆柱型腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、直肠癌也有明显疗效；对恶性葡萄胎，绒毛膜上皮癌、肺癌、急慢性粒细胞、白血病、银屑病、治疣及血吸虫病引起的肝脾肿大等也具有很好的疗效。
随着对喜树碱及其衍生物抗肿瘤机理的深入研究，以及国际市场对喜树碱类药物的需求，使喜树碱类药物的研发成为热点。目前全球共有几十家分布于美国、法国、日本、意大利等国的科研机构和制药公司从事相关研究，第ⅲ代乃至第ⅳ代喜树碱类药物已在研制开发之中。由于喜树碱及其衍生物疗效远胜于紫杉醇，所以，喜树碱及其衍生物将是未来最有前途的抗癌药物。
目前，国内一般主要是从天然植物喜树中直接获得喜树碱粗提物，粗提物产品的纯度较低。虽然通过柱层析和重结晶精制，其纯度可进一步提高，但由于喜树碱在喜树中的含量很低，其收率会大幅度下降。为了更好地开发和利用武陵山区的特色植物资源马比木，对利用微生物发酵技术从马比木中大规模高效提取分离高纯度植物单体喜树碱提出了合理化的生产工艺路线。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用微生物发酵技术从马比木中大规模高效提取分离高纯度植物单体喜树碱的方法。
利用微生物发酵技术从马比木粗提物中分离高纯度药用植物单体喜树碱的方法，按以下步骤进行：
一、提取工艺
1、原料粉碎：先用切片机将马比木原木切成片料，然后用粉碎机将片料粉碎成颗粒。
2、发酵：发酵前24小时先按每2吨原料量对酶(1～2kg安琪高糖干酵母或发利干酵母)进行醪化处理。发酵时应将原料与水及醪化液搅拌均匀(人工或机械搅拌好)，放入以整张大棚膜垫好的发酵池中，大棚膜应完好、无破损，装入原料后将大棚膜各边收拢捆扎密封，封口处以薄膜捆扎密封，密封保温。发酵时间大约为2～3天(视气温不同)。
3、装锅量(8立方米提取罐)：600公斤(风干料)。
4、提取：第一次提取：甲醇(酒精度70～80)，8～10倍物料量，3～5小时，25～40℃；第二次提取：甲醇(酒精度70～80)用量：6～8倍物料量。3～5小时，25～40℃；第三次提取：甲醇(酒精度70～80)，4～6倍物料量。3～5小时。25～40℃
5、甲醇回收：到无醇味(酒精度30左右)停止回收。倒料、除渣。
二、浓缩参数
1、浓缩温度：75～90℃。
2、真空度：－0.05±0.01mpa。
3、抗氧化剂(二氧化硫、硫酸亚铁中的一种或两种)用量：0.02～0.05％(相对甲醇)。
4、蒸汽压力：≤0.1mpa。
5、浸膏量：180～220升(对一罐原料而言)。
三、萃取工艺
1、设备：500～1000升萃取罐一个。
2、浸膏调ph值2～6，加氯仿量600～1000升(对应一罐原料浸膏而言,分三次萃取)，最后取酸水用高压液相设备检测，当酸水中喜树碱和9-甲氧基喜树碱含量低于200升/5克，即为萃取结束。
3、回收萃取的氯仿，得喜树碱和9-甲氧基喜树碱粗品混合膏体。
四、精制工艺(对于一公斤粗品而言)
1、加20～50升丙酮(相对于膏体)，搅拌均匀，静置12～24小时分层，抽滤，得粗品，回收母液中的丙酮；
2、加甲醇：氯仿＝1：3混合液50～70升，溶解上一步的粗品，搅拌均匀，静置分层，抽滤，得粗品；
3、粗品：naoh＝1：1～1.2，配成2～5％的碱水溶液，溶解粗品过滤，得清液，加酸水,调ph＝2～6,静置分层，抽滤，得粗品；
4、一公斤粗品溶于150～250l氯仿,加热(50～60℃),浓缩到原体积的1/2～1/3结束,静置，冷却,析晶,分层，抽滤，得粗品,母液回收氯仿,其中再析出的喜树碱回到第2步；
5、将上一步的粗品溶于氯仿,用2～5％的碱水萃取,少量多次萃取,收集萃取液,调ph＝2～6,静置分层，抽滤，得粗品；
6、将上所得产品溶于混合溶剂(dmf:甲醇:丙酮＝6:3:2)混合液,装入打浆瓶中,加热(80-～90℃)2～5小时,趁热过滤；
7、用蒸馏水淋洗上一步抽滤的滤饼,洗尽残余溶剂，得喜树碱产品；
8、减压干燥(温度小于80℃)喜树碱产品,粉碎,装袋,入库。
由于上述工艺技术方案是在常温下进行的，其操作简便易行，所提取的粗品经浸提，减压浓缩，重结晶，打浆等工序，最后获得了高纯度的喜树碱产品，其有效含量可高达99％以上，是一种分离效果好，效率高，操作较为简便的方法。
本方法很适合于从马比木的粗提物中来分离制备高纯度的喜树碱产品。
具体实施方式
实施方案：
一、提取工艺
1、原料粉碎：先用切片机将马比木原木切成片料，然后用粉碎机将片料粉碎成颗粒。
2、发酵：发酵前24小时先按每2吨原料量对酶(1～2kg安琪高糖干酵母或发利干酵母)进行醪化处理。发酵时应将原料与水及醪化液搅拌均匀(人工或机械搅拌好)，放入以整张大棚膜垫好的发酵池中，大棚膜应完好、无破损，装入原料后将大棚膜各边收拢捆扎密封，封口处以薄膜捆扎密封，密封保温。发酵时间大约为2～3天(视气温不同)。
3、装锅量(8立方米提取罐)：600公斤(风干料)。
4、第一次提取
a、甲醇(酒精度70～80)用量:8～10倍物料量。
b、提取时间：3～5小时。
c、提取温度：25～40℃(温度每上升或下降5℃，时间提前或延长30分钟)。
5、第二次提取
a、甲醇(酒精度70～80)用量：6～8倍物料量。
b、提取时间：3～5小时。
c、提取温度：(同上)。
6、第三次提取
a、甲醇(酒精度70～80)用量:4～6倍物料量。
b、提取时间：3～5小时。
c、提取温度：(同上)。
7、甲醇回收：到无醇味(酒精度30左右)停止回收。
8、倒料、除渣。
二、浓缩参数
1、浓缩温度：≤75～90℃。
2、真空度：－0.05±0.01mpa。
3、抗氧化剂(二氧化硫、硫酸亚铁中的一种或两种)用量：0.02～0.05％(相对甲醇)。
4、蒸汽压力：≤0.1mpa。
5、浸膏量：200升(对一罐原料而言)。
三、萃取工艺
1、设备：1000升萃取罐一个。
2、浸膏调ph值2～6，加氯仿量800升(对应一罐原料浸膏而言,分三次萃取)，最后取酸水用高压液相设备检测，当酸水中喜树碱和9-甲氧基喜树碱含量低于200升/5克，即为萃取结束。
3、回收萃取的氯仿，得喜树碱和9-甲氧基喜树碱粗品混合膏体。
四、精制工艺(对于一公斤粗品而言)
1、加20～50升丙酮(相对于膏体)，搅拌均匀，静置12～24小时分层，抽滤，得粗品，回收母液中的丙酮；
2、加甲醇：氯仿＝1：3混合液50～70升溶解上一步的粗品，搅拌均匀，静置分层，抽滤，得粗品；
3、粗品：naoh＝1：1～1.2，配成2～5％的碱水溶液，溶解粗品过滤，得清液，加酸水,调ph＝2～6,静置分层，抽滤，得粗品；
4、一公斤粗品溶于150～250l氯仿,加热(50～60℃),浓缩到体积为90l结束,静置，冷却,析晶,分层，抽滤，得粗品,母液回收氯仿,其中再析出的喜树碱回到第2步；
5、将上一步的粗品溶于氯仿(30l),用2～5％的碱水萃取,少量多次萃取,收集萃取液,调ph＝2～6,静置分层，抽滤，得粗品；
6、将上所得产品溶于混合溶剂(dmf:甲醇:丙酮＝6:3:2)混合液,装入打浆瓶中,加热(80～90℃)2～5小时,趁热过滤；
7、用蒸馏水淋洗上一步抽滤的滤饼,洗尽残余溶剂，得喜树碱产品；
8、减压干燥(温度小于80℃)，得高纯度喜树碱产品412克,粉碎,装袋,入库。
上述所得的药用植物单体喜树碱，其纯度高达99％以上(高压液相检测)。很适合于大规模工业化生产。