本发明属于流脑A群荚膜多糖制备领域，具体地，涉及一种提高流脑A群荚膜多糖产率的制备方法。
背景技术：
：脑膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）简称为脑膜炎球菌（meningococcus），是流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）的病原菌。一百多年来，流脑一直在世界各地流行或散在发生，是人类的主要急性呼吸道传染病之一。很多国家经过长期的流行病学监测，发现此病具有周期性流行的特点。意大利发现1915-1934年在其国内发生了三次流行。我国也出现过五次全国性大流行，在1938、1949、1959、1967及1977年，约每8-10年出现一次流行高峰。据WHO报告，近十余年来发病率平均为2.5/10万。当今世界各大洲发病率在1/10万-10/10万，国内1967年的大流行，全国发病率及病死率均较高。发病数占传染数的第四位，而死亡数占全部传染病死亡数的60%，严重危害人民健康及影响计划生育。其主要的特点为：易感人群主要是为儿童，以爆发型病死率最高，可达40%-60%。流脑的预防，主要采取以疫苗接种为主的预防措施。1980年，我国正式生产A群NM多糖疫苗，推广应用取得了很好的效果。但多糖疫苗对2岁以下的婴幼儿预防效果较差，结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题。结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。制备流脑A群结合疫苗首先要获得流脑A群荚膜多糖，目前传统的生产方式生产流脑A群荚膜多糖的产率较低，提高了疫苗生产过程中的成本，这也是使流脑A群疫苗价格较高的其中一个原因。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种提高流脑A群荚膜多糖产率的制备方法。本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种提高流脑A群荚膜多糖产率的制备方法，包括以下步骤：1）开启菌种及传代：开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；2）接种到种子罐培养：将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；3）发酵罐发酵：将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36℃，深层通气200rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100-200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；4）纯化：加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2-8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75-80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次。综上，本发明的有益效果是：本申请通过对流脑A群荚膜多糖的制备工艺进行优化，提高流脑A群荚膜多糖的产率，降低疫苗生产过程中的成本。具体实施方式下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。实施例1一种提高流脑A群荚膜多糖产率的制备方法，包括以下步骤：1）开启菌种及传代：开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；2）接种到种子罐培养：将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；3）发酵罐发酵：将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36℃，深层通气200rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100-200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；4）纯化：加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2-8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75-80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，检测并将结果记录于下表1中。表1批次复合多糖产量g/L多糖产量g/L固总mg/mL实施例16.120.45.755从上表1中可以看出，本申请通过对流脑A群荚膜多糖的制备工艺进行优化，提高流脑A群荚膜多糖的产率，降低疫苗生产过程中的成本。如上所述，可较好的实现本发明。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。当前第1页1 2 3