本发明涉及一种还原型辅酶Q10，尤其涉及一种还原型辅酶Q10的生产方法。
背景技术：
辅酶Q10自上世纪中期被科学家发现、并确认其化学结构以来，它在人体生理和生命过程中的重要作用也日渐被我们所认识。
辅酶Q10又名泛醌10，是一种脂溶性醌，在室温下是橙黄色结晶物，熔点48℃，无臭无味，其结构类似于维生素K，因其母核六位上的侧链(聚异戊二烯基的聚合度为10而得名)是一种醌类化合物。它的另一种形式为还原型辅酶，生理功能主要来源于醌基的氧化还原特性和类异戊二烯侧链的物理特性。
随着人类对生命科学研究的日益深入，自Harman于1956年提出了衰老的自由基学说以来，越来越多的实验资料从不同方面证实了自由基氧化损伤生物大分子是造成机体衰老和多种老年性疾病发生的原因。而用抗氧化剂能够有效地清除自由基，具有延缓衰老的功能。
上世纪80年代初，瑞典Ernster揭示出类维生素物质辅酶Q10的抗氧化作用和自由基清除作用。1972年Harman阐述了线粒体的功能与衰老的关系，最新关于线粒体衰老在机体衰老过程作用的报告认为：氧自由基对线粒体DNA的损伤程度较对核DNA高16倍。其原因可能与线粒体基质中DNA更易接近内源性氧自由基，并且线粒体内DNA修复机制远不如核DNA。因此推论，随着年龄的增长线粒体DNA内亚单位受自由基损伤增大。
在人的肌体内93％是还原型辅酶Q10，7％是氧化型辅酶Q10，起上述2个主要作用的辅酶Q10是属于还原型辅酶Q10。所以生产还原型辅酶Q10是对人体有直接的积极意义，特别是天然的还原型辅酶Q10。但是，由于还原型辅酶Q1容易被分子氧氧化，目前还未见具有工业规模生产还原型辅酶Q10技术方面的报道。
此外，由于还原型辅酶Q10是氧化型辅酶Q10的二电子还原体，因此在目前公诸于世的众多涉及还原型氧辅酶Q10制作技术中，都是通过用还原剂将氧化型辅酶Q10作为原料，还原生成还原型辅酶Q10。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种还原型辅酶Q10的生产方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种还原型辅酶Q10的生产方法，包括以下步骤：
(1)选用人的细胞系或细胞株作为生产还原型辅酶Q10的母本材料。
(2)取1-10L DMEM培养液在110-130℃下灭菌5-15分钟，加入占培养液体积5-15％的母本材料，在温度为35-39℃，CO2体积分数为3-7％的环境下，搅拌培养24-72小时，得到细胞液。
(3)向培养液中加入20-40mL酸液搅拌混合均匀，然后离心分离，收集得到含细胞湿物体，用水洗涤2-4次后，得到洗净细胞体。
(4)在洗净细胞体中加入10-50g的水使之成为浆状，通过喷雾干燥处理后获得干燥的细胞体。
(5)向干燥的细胞体中加入有机溶剂500-1500mL，在40-60℃下搅拌25-35分钟后，离心分离，除去有机溶剂相；再次加入有机溶剂300-700mL，在40-60℃下搅拌25-35分钟后，过滤，得到提取液。
(6)将提取液进行5-15小时的冷却处理至4℃，使还原型辅酶Q10的生产方法析出，将上层有机溶剂倒去，得到还原型辅酶Q10的生产方法的湿结晶，减压干燥即得。
优选地，所述的酸液为酸的水溶液，其中酸的摩尔浓度为0.1-1mol/L。
优选地，所述的酸为草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸中一种或多种的混合物。
更优选地，所述的酸由草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸混合而成，所述草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸的摩尔比为(1-3)：(1-3)：(1-3)。
优选地，所述的有机溶剂为1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇中一种或多种的混合物。
更优选地，所述的有机溶剂由1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇混合而成，所述1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇的质量比为(1-3)：(1-3)：(1-3)。
优选地，所述的酸液用量为细胞液体积的0.5-5％。
优选地，所述的有机溶剂用量为细胞液体积的45-95％。
所采用的人的细胞系或细胞株为：肺部细胞系、肝部细胞系、肾部细胞系、胃肠部细胞系、真皮细胞系、尿道细胞系、生殖细胞系、淋巴细胞系、骨细胞系、骨骼肌细胞系、脐带细胞系、间叶干细胞系、内皮细胞系中的任一种。
具体的，在本发明中：
草酰乙酸，CAS号：328-42-7。
延胡索酸，CAS号：110-17-8。
琥珀酸，CAS号：110-15-6。
1,2-丙二醇，CAS号：57-55-6。
1,3-丙二醇，CAS号：504-63-2。
乙醇，CAS号：64-17-5。
本发明还原型辅酶Q10的生产方法，与现有方法相比较，制备过程中不添加碱性物质，性质稳定，不会被空气的氧氧化；既没有还原剂的残留物，也没有任何抗氧化剂，保护剂等化学残留，是一种高品质的还原型辅酶Q10的生产方法；能用于食品，药品，化妆品，或者可用于针剂，输液之用，对人体没有免疫原性反应。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
还原型辅酶Q10的生产方法，包括以下步骤：
(1)选用人体肝細胞系Fa2N-4(ATCC-5566)作为生产还原型辅酶Q10的母本材料。
(2)取2.2L DMEM培养液(采用友康恒业生物科技(北京)有限公司提供的货号为CM0103的DMEM(高糖)含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠细胞培养液)在121℃下灭菌10分钟，加入占培养液体积10％的生产还原型辅酶Q10的人体肝細胞系Fa2N-4(ATCC-5566)，在温度为37℃，CO2体积分数为5％的环境下，搅拌转数为300转/分条件下培养48小时，得到细胞液。
(3)向培养液中加入30mL酸液搅拌混合均匀，然后在3000转/分下离心分离10分钟，收集得到含细胞湿物体，用去离子水洗涤3次后得到198g洗净细胞体。
(4)在洗净细胞体中加入25g的去离子水使之成为浆状，通过喷雾干燥机(采用上海桂戈实业有限公司提供的型号为GG-6000Y的喷雾干燥机)在温度为60℃，蒸发水量为1600mL/h的条件下喷雾干燥处理后获得干燥的细胞体。
(5)向干燥的细胞体中加入有机溶剂1000mL，在50℃下以转速300转/分搅拌30分钟后，在3000转/分下离心分离10分钟，除去有机溶剂相；再次加入有机溶剂500mL，在50℃下以转速400转/分搅拌30分钟后，过滤(采用南京聚康医药化工有限公司提供的型号为FPV403000的1000mL真空式过滤器，PVDF聚偏氟乙烯膜，膜孔径为0.45μm)，得到提取液。
(6)将提取液由常温24℃开始降温，降温速率为2℃/h(即1小时降温2℃)，降温10小时至4℃，使还原型辅酶Q10析出，将上层有机溶剂倒去，得到还原型辅酶Q10的湿结晶，再在温度为35℃、压力为10mmHg的条件下减压干燥6小时。得到实施例1的还原型辅酶Q10。
所述的酸液为酸的去离子水溶液，其中酸的摩尔浓度为0.24mol/L。将酸加入去离子水中混合均匀即得酸液。
所述的酸由草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸按摩尔比为1：1：1混合均匀得到(即酸液中草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸的摩尔浓度均为0.08mol/L)。
所述的有机溶剂由1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇按质量比为1：1：1混合均匀得到。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的酸由延胡索酸、琥珀酸按摩尔比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例2的还原型辅酶Q10。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的酸由草酰乙酸、琥珀酸按摩尔比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例3的还原型辅酶Q10。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的酸由草酰乙酸、延胡索酸按摩尔比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例4的还原型辅酶Q10。
实施例5
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的有机溶剂由1,3-丙二醇、乙醇按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例5的还原型辅酶Q10。
实施例6
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的有机溶剂由1,2-丙二醇、乙醇按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例6的还原型辅酶Q10。
实施例7
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：所述的有机溶剂由1,2-丙二醇、1,3-丙二醇按质量比为1：1搅拌混合均匀得到。得到实施例7的还原型辅酶Q10。
测试例1
将实施例1-7制备的还原型辅酶Q10进行称量。各实施例得到的还原型辅酶Q10重量见表1。
表1：还原型辅酶Q10的生产方法重量表
比较实施例1与实施例2-4，实施例1(草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸复配)还原型辅酶Q10产量明显优于实施例2-4(草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇复配)还原型辅酶Q10产量明显优于实施例5-7(1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇中任意二者复配)。
测试例2：
将实施例1-7制备的还原型辅酶Q10的纯度进行测试，采用高效液相色谱法，Waters2695高效液相色谱仪，色谱柱：SYMMETRY C18(Waters制)，250mm(长度)，4.6mm(内径)、流动相：C2H5OH：CH3OH＝4：3(v：v)、检测波长：210nm、流速：1mL/min、还原型辅酶Q10的保留时间：9.1min。实验结果见表2。
表2：纯度测试结果表
比较实施例1与实施例2-4，实施例1(草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸复配)纯度明显优于实施例2-4(草酰乙酸、延胡索酸、琥珀酸中任意二者复配)；比较实施例1与实施例5-7，实施例1(1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇复配)纯度明显优于实施例5-7(1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、乙醇中任意二者复配)。