一种化合物及其在防治黄曲霉和/或黄曲霉毒素污染中的应用的制作方法

本发明涉及化合物制备技术领域，更具体地，涉及一种化合物及其在防治黄曲霉和/或黄曲霉毒素污染中的应用。

背景技术：

黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种常见的丝状土壤腐生真菌，也是一种危害极大的病原菌，易于侵染植物、动物和人。黄曲霉易导致许多重要农作物发病，如玉米穗腐病、花生曲霉病和棉花棉铃腐烂等，造成重大的经济损失。黄曲霉也易使人和动物患上曲霉病，影响健康，严重时还会导致死亡。

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，具有急慢性毒性、致癌性、致突变性和致畸性，对人及动物肝脏组织具有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，是迄今发现的各种真菌毒素中最稳定和最毒的一种。AFs为一类基本结构为二呋喃环和香豆素的聚酮化合物，目前分离鉴定的已超过20种，主要为AFB₁（Aflatoxin B₁）、AFB₂、AFG₁、AFG₂等，其中AFB₁污染最为常见，毒性最强，是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，被世界卫生组织定义为Ⅰ类可能致癌物，是世界公认的三大强致癌物之一。

AFs污染是一个普遍的现象，主要污染玉米、花生、大米等粮食和粮食制品、坚果、植物油、乳制品、调味品及饲料等，其中以花生和玉米污染最严重。AFs污染已对食品药品安全和农产品的经济价值产生严重影响，已成为一项全球性的社会和经济问题。为了保证食品药品安全，降低AFs对人类的危害，很多国家和地区都对AFs做出了严格的限量规定。黄曲霉毒素的污染源头在于产毒真菌，消除产毒真菌是控制黄曲霉毒素污染的关键。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供一种新分离并被鉴定的化合物。

本发明的第二个目的是提供上述化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述化合物的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种化合物，所述化合物的结构式为：

。

上述化合物包括5R和5S两种手性构型，所述化合物的分子式为C₁₆H₁₄O₆，分子量为302。

优选地，所述化合物为5S构型，即5S-乙酰基-3-苯甲酰基氧甲基-5H-氧杂-4-酮。

本发明从假鹰爪属植物中提取获得一种新的化合物，将所述化合物加入到接种黄曲霉孢子的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）中，均能抑制黄曲霉的生长，将所述的化合物加入到如饲料等样品中，能抑制黄曲霉的生长，降低黄曲霉和/或黄曲霉毒素污染。

本发明还提供所述化合物的提取方法，是将假鹰爪属植物的叶片粉碎，制成醇提取物，再经柱层析、制备液相色谱分离制得。

优选地，所述提取方法包括以下步骤：

（1）假鹰爪植物叶片粉碎至30～300目。

（2）取植物叶片粉末500 g，加无水乙醇4 L，超声处理2 h后过滤，滤液蒸干后加少量二氯甲烷溶解；经硅胶（200～300目）柱层析，以石油醚：乙酸乙酯（4：1）为洗脱剂洗脱。

（3）取硅胶柱层析的洗脱液蒸干，加少量甲醇溶解并用制备液相分离。

（4）以甲醇：水（50：50）为流动相；采用Marsh C18制备柱（50 × 700 mm，5 μm）为固定相。

（5）保持流速为80 mL/min；检测波长为233 nm；色谱柱温度为室温；取0.3 mL待制备样品注入制备液相仪。

（6）收集化合物所对应色谱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干即得。

所述化合物在甲醇-水（甲醇与水的体积比为55：45）溶剂中，在233 nm波长处有最大吸收。

优选地，所述假鹰爪属植物选自假鹰爪（Desmos chinensi）、毛叶假鹰爪（D. dumosus）、大叶假鹰爪（D. grandifolius）或云南假鹰爪（D. yunnanensis）。

本发明还提供了上述化合物及其外消旋混合物、对映体、非对映体或者其药学上可接受的盐或酯在抑制和/或杀死黄曲霉中的应用。

本发明还提供了上述化合物及其外消旋混合物、对映体、非对映体或者其药学上可接受的盐或酯在制备抑制和/或杀死黄曲霉的药剂中的应用。

本发明还提供了上述化合物及其外消旋混合物、对映体、非对映体或者其药学上可接受的盐或酯在防治黄曲霉毒素污染中的应用。

优选地，所述化合物的用量为不少于0.02mg/10⁵个黄曲霉孢子。

更优选地，当PDB中孢子浓度为10⁵个/mL时，最小抑菌浓度为0.02mg/mL。

更优选地，当PDB中孢子浓度为10⁵个/mL时，最小杀菌浓度为0.2 mg/mL。

更优选地，当PDA中孢子浓度为10⁵个/mL时，化合物起抑菌作用的最少用量为50 μg。

本发明还提供一种用于抑制黄曲霉生长和/或降低黄曲霉毒素污染的方法，即将上述化合物喷洒或混合到需要进行黄曲霉和/或黄曲霉毒素防治的对象上。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过从假鹰爪属植物中提取获得一种新的化合物，将所述化合物加入到接种黄曲霉孢子的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）中，均能抑制黄曲霉的生长，将所述的化合物加入到如饲料、涂料等样品中，能抑制黄曲霉的生长，降低黄曲霉和/或黄曲霉毒素污染；本化合物来自天然植物资源，将该化合物用于防治黄曲霉和/或黄曲霉毒素污染具有环境友好，作用效果明显，效果理想等优点。本发明对发展预防控制AFs污染的有效方法与技术具有重要的理论和实际价值。

附图说明

图1是化合物的化学结构式。

图2是化合物的紫外光谱图。

图3是化合物的一级质谱图。

图4是化合物质子加合离子峰的二级质谱图。

图5是化合物的 ¹H-NMR图谱（CD₃OD）。

图6是化合物的 ¹³C-NMR图谱（CD₃OD）。

图7是化合物的 DEPT图谱（CD₃OD）。

图8是化合物的COSY图谱（CD₃OD）。

图9是化合物的 HSQC图谱（CD₃OD）。

图10是化合物的HMBC图谱（CD₃OD）。

图11是化合物的圆二色谱图（甲醇）。

图12是化合物的最小抑菌浓度实验图。

图13是化合物在PDB培养基中对黄曲霉生长的影响。

图14是取化合物在PDB培养基上培养2天后的溶液涂布在PDA培养基上菌的生长情况。

图15是化合物在PDA培养基上的抑菌情况。

图16是化合物在饲料中的抑菌情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1化合物的提取分离

（1）取假鹰爪植物叶片洗净，晾干，用高速万能粉碎机粉碎。

（2）取植物叶片粉末500 g，加无水乙醇4 L，超声处理2 h，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干后加少量二氯甲烷溶解；经硅胶（200～300目）柱层析，以石油醚：乙酸乙酯（4：1）为洗脱剂洗脱，洗脱液循环使用。

（3）取硅胶柱层析的洗脱液用旋转蒸发仪蒸干，加少量甲醇溶解并用制备液相分离。

（4）以甲醇：水（50：50）为流动相；采用Marsh C18制备柱（50 × 700 mm，5 μm）为固定相。

（5）保持流速为80 mL/min；检测波长为233 nm；色谱柱温度为室温；取0.3 mL待制备样品注入制备液相仪。

（6）收集化合物所对应色谱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干，置-20℃保存（紫外光谱如图2）。

实施例2化合物的鉴定

（1）取实施例1提取到的化合物用甲醇溶解，采用液相色谱-飞行时间质谱联用仪进行一级质谱分析（图3），并取质子加合离子峰进行二级质谱分析（图4）。

（2）根据液相色谱-飞行时间质谱联用仪实验结果推测化合物的分子式为C₁₆H₁₄O₆，分子量为302。

（3）取化合物采用元素分析仪进行元素分析，确认化合物分子结构中没有N元素和S元素，且C元素和H元素的比例结果和高分辨质谱推断结果一致。

（4）取化合物，采用CD₃OD作为溶解，进行¹H-NMR、¹H-¹HCOSY、¹³C-NMR、 DEPT、HSQC和HMBC等核磁共振试验（图5～10），化合物的¹H-NMR，¹³C-NMR，HMBC和COSY核磁共振谱结果（CD₃OD）见表1，推测其结构式如图1。

（5）取化合物的甲醇溶液，用圆二色光谱仪测定其圆二色光谱值（图11）。

实施例3化合物的最小抑菌浓度

（1）在马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）溶液（2.4 g/100 mL，pH值为5.1）中加入黄曲霉孢子，终浓度为10⁵个/mL，往24孔板中加入含孢子的PDB，每孔为2 mL。

（2）在24孔板微孔中分别加入2 mg/mL的化合物甲醇溶液 100 μL，50 μL，25 μL，12 μL，6 μL，0，并以甲醇100 μL，50 μL，25 μL，12 μL，6 μL，0为对照，每种浓度点两个孔。

（3）于30℃避光静置培养60 h，抑菌情况如图12。加入化合物甲醇溶液25 μL及以上体积的微孔培养液澄清，无观察到的黄曲霉生长，最小抑菌浓度为0.02 mg/mL。

实施例4化合物的最小杀菌浓度

（1）在马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）溶液（2.4 g/100 mL，pH值为5.1）中加入黄曲霉孢子，终浓度为10⁵个/mL，往24孔板中加入含孢子的PDB，每孔为2 mL。

（2）在24孔板微孔中分别加入8 mg/mL的化合物甲醇溶液 200 μL，100 μL，50 μL，25 μL，并以甲醇200 μL，100 μL，50 μL，25 μL为对照，每种浓度点两个孔。

（3）于30℃避光静置培养2d，分别取实验中没有明显黄曲霉生长的培养液各200 μL，涂布到新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基上，30℃培养5 d观察PDA培养基黄曲霉生长情况，剩余的液体培养样品继续于30℃避光静置培养5 d时观察抑菌情况。在PDB培养基上培养共7 d和在PDA培养基上培养共5d的抑菌情况分别如图13和14。加入化合物甲醇溶液50 μL及50 μL以上体积的培养液所对应的PDA均未见黄曲霉生长，化合物的最小杀菌浓度为0.2 mg/mL。

实施例5化合物在固体培养基上的抑菌情况

往含黄曲霉孢子浓度为10⁵个/mL的PDA培养基孔径（7mm）内加入2 mg/mL的化合物甲醇溶液 25 μL，50 μL，100 μL，并以甲醇溶液100 μL为对照，于30℃避光静置培养2 d，抑菌情况分别如图15，表明化合物具有明显的抑制黄曲霉生长的活性。

实施例6化合物在饲料中的抑菌情况

（1）取黄曲霉孢子(10³个/mL) 100 μL置15 mL水中，混匀，作为含黄曲霉孢子的水溶液；

（2）取50 mL锥形瓶四个，每瓶均加饲料各5 g，经121 ℃高压灭菌15 min。往第一个锥形瓶直接加不含黄曲霉孢子的水1.5 mL作为阴性对照(1#)，往剩余三个锥形瓶分别加黄曲霉孢子的水溶液1.5 mL，黄曲霉孢子的水溶液1.5 mL和甲醇100 μL，黄曲霉孢子的水溶液1.5 mL和化合物溶液(取化合物适量，用甲醇溶解并配制成浓度为8 mg/mL的溶液) 100 μL，混匀，作为阳性对照(2#)、溶剂对照(3#)和化合物样品瓶(4#)。每组平行操作。

（3）密封锥形瓶口，室温放置30 d后，抑菌情况分别如图16。未接种黄曲霉孢子的阴性对照(1#)无黄曲霉生长，接种黄曲霉孢子的阳性对照(2#)和溶剂对照(3#)均有黄曲霉生长，而接种黄曲霉孢子且加入化合物的样品瓶(4#)无黄曲霉生长，表明化合物添加到饲料中具有明显的抑菌效果。