一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法与流程

文档序号:11809188阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:

1)白地霉培养和孢子收集

在固体琼脂培养基表面接种白地霉,培养至培养基表面长满白地霉孢子,洗下培养基表面的白地霉孢子,吸出孢子悬液并过滤去除菌丝,收集含有孢子的滤液,将滤液离心,收集沉淀的休眠孢子;

2)白地霉孢子预处理

用电击缓冲液重悬孢子,离心并收集孢子沉淀,重复上述重悬和离心步骤3-4次后,将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中,得到孢子浓度为104-1011个/ml的白地霉孢子悬液;

所述电击缓冲液由终浓度为0.01-100mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5-5000mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为3.0-9.5;

3)使用HDEN法电击白地霉孢子

在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的白地霉孢子悬液以及待转化质粒,混匀,得到孢子与质粒混合物,将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后采用Etta Biotech X-Porator H1电转仪进行HDEN法电击,将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部,通电,使得孢子与质粒混合物内部产生电场,电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10-15min,然后将孢子和质粒混合物吸出,得到导入外源DNA的休眠的白地霉孢子;

所述白地霉悬液与待转化质粒的比例为:6-600000μl的白地霉孢子悬液:0.1-10000μg的待转化质粒;

所述电击参数如下:电压1-6000V,脉宽2-2000000ms,重复1-100次,每次间隔5-50000ms。

2.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤1)的培养基为PDA培养基、YPD培养基或察氏培养基。

3.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤1,)白地霉的培养条件为:温度16-40℃,湿度15-85%,培养3-15日。

4.根据权利要求3所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤1),白地霉的培养条件为:温度28℃,湿度50-60%,培养7日。

5.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤2),电击缓冲液由终浓度为1mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为50mmol/L的甘露醇组成,电击缓冲液的pH为7.0。

6.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤2)的白地霉孢子悬液在电击前,于显微镜下观察,确认孢子悬液中无菌丝体混杂污染并且孢子均未萌发,然后再进行电击。

7.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤3),待转化质粒为重组质粒AnEp8-hygro,所述重组质粒AnEp8-hygro由潮霉素B抗性基因和AnEp8质粒构建而成。

8.根据权利要求7所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤3),白地霉悬液与重组质粒AnEp8-hygro的比例为:60μl的白地霉孢子悬液:1μg的重组质粒 AnEp8-hygro。

9.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于: 所述步骤3),电击参数如下:电压520V,脉宽2000ms,重复4次,每次间隔300ms。

10.根据权利要求1所述的一种对白地霉休眠孢子转化外源DNA的方法,其特征在于:所述步骤3),还包括如下处理:将孢子和质粒混合物吸出,涂布在含有终浓度为700μg/ml的潮霉素B的YPD固体琼脂培养基平板上,于温度16-40℃,湿度15-85%下培养,直至形成单菌落,并进行菌落计数。

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