一种分离的中黑盲蝽△9‑desaturase基因及其编码的蛋白的制作方法

本发明涉及昆虫基因工程技术领域。具体涉及一种分离的中黑盲蝽△9-desaturase基因及其编码的蛋白。本发明还包括一条中黑盲蝽△9-desaturase基因的rna干扰序列的应用，通过生物学验证，本发明的△9-desaturase基因的rna干扰序列可用于转基因抗虫植物的开发。

背景技术：

中黑盲蝽(adelphocorissuturalis)隶属半翅目盲蝽科(hemiptera:miridae)，是一种多食性害虫，目前已记载的寄主植物有50科270种，嗜食棉花、小麦、大豆和苜蓿等(姜玉英等.,2015)。自1997年转基因bt棉商业化种植以来，化学农药使用量的急剧减少导致盲蝽田间的种群数量剧增，中黑盲蝽由原来的次生害虫逐渐上升为主要害虫(luetal.,2008；luetal.,2010)，已成为我国棉花种植区域的一类重要害虫。目前对于中黑盲蝽的防治以化学防治为主(刘仰青等,2007)。由于中黑盲蝽危害较为隐蔽，活动迅速敏捷且易转株危害，严重影响化学药剂的防治效果(徐文华等,2007)。同时，长期大量使用化学农药也带来产生抗药性，杀伤天敌，破坏生态平衡，污染环境，对人畜健康造成威胁等问题。因此，开发和利用符合环保、健康、持续发展理念的无公害防治措施是未来盲蝽防治的主要发展方向。

化学信息素作为昆虫种内或者种间识别与交流重要介质，具有高度的种特异性，其调控着昆虫交配、取食、产卵、防御、聚集等行为，对昆虫种群的生存和发展具有决定性的作用。由于利用信息素防治害虫具有高效、无毒、环境友好且靶标性强等优点，进几十年来分离鉴定信息素的组分，理解各组分的功能，解读信息素生物合成及调控的机制及探寻昆虫信息素交流进化过程中的关键受到了广大科研工作者的关注。自从butenaudt和karlson(1959)鉴定并提纯出第一个昆虫性信息素——蚕醇(bombykol)后，目前已有超过2000种昆虫的信息素组分被鉴定(在线数据统计,thepherobase,http://www.pherobase.com,)，信息素的生物合成分子机制也在鳞翅目昆虫中被广泛的研究和报道。

desaturase是催化不饱和反应的主要酶类，广泛的存在于各种真核生物体内，包括：动物、植物、酵母、真菌以及各种细菌(losandmurata,1998；sperlingetal.,2003)。其作用是在脂酰基质特定位点引入碳碳双键生成各种不饱和脂肪酸，在脂类代谢、细胞信号传导以及维持细胞膜的流动性等基础生命活动中均具有重要的作用(hazelandwilliams,1990；vighetal.,1993；pyneandpyne,2000；miyazakiandntambi,2003)。此外，desaturase还参与了许多昆虫的信息素的合成过程(knippleetal.,2002；roelofsandrooney,2003；etal.,2013)，其通过在不同的位点催化形成不同空间构型(z型或者e型)的双键来实现信息素组分的多样性，已被证明是一些鳞翅目及双翅目昆虫信息素交流进化中的关键酶类(knippleetal.,2002；etal.,2015)。

目前对于盲蝽科，乃至半翅目昆虫的信息素的相关研究尚处于信息素组分鉴定的阶段，关于其信息素生物合成的分子机制仅有少数文献进行了推测，未见任何明确的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有的防治方法的不足，提供一种分离的中黑盲蝽△9-desaturase基因及其编码的蛋白，其中包括该基因的rna干扰序列，为利用△9-desaturase扰乱中黑盲蝽性信息素交流系统，控制其种群的发展提供了技术基础。

本发明运用rna干扰技术，通过体外注射中黑盲蝽△9-desaturase基因干扰序列的dsrna，发现抑制中黑盲蝽△9-desaturase基因的表达，改变了其信息素组分4-氧代-反-2-己烯醛的含量，显著抑制了雌虫对雄虫的引诱能力。本发明首次发现△9-desaturase参与了中黑盲蝽信息素的生物合成，为通过干扰中黑盲蝽性信息素交流系统，控制其种群的发展，最终实现绿色防治害虫的目的提供了技术基础，也为进一步了解半翅目昆虫信息素的生物合成分子机制提供了帮助。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人分离了一种中黑盲蝽△9-desaturase基因，其cdna序列如seqidno：1所示，序列全长为1077bp。

申请人分离了一种中黑盲蝽△9-desaturase基因编码的蛋白，其蛋白质序列如seqidno：2所示，编码358个氨基酸残基。

基于上述基因的分离和克隆，本发明还提供△9-desaturase基因的rna干扰序列，该干扰序列为双链rna分子，利用特异性引物体外合成该序列的dsrna，显微注射至新羽化中黑盲蝽雌虫体内，结果显示该序列可显著抑制△9-desaturase基因的表达。进一步研究沉默△9-desaturase基因对中黑盲蝽雌虫引诱能力及其信息素滴度的影响，结果发现抑制△9-desaturase基因的表达显著降低了中黑盲蝽雌虫对中黑盲蝽雄虫的引诱能力，并改变了其信息素组分4-氧代-反-2-己烯醛的含量。该干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。

合成dsrna特异性引物的序列如下：

上游引物ds△9-des-f：ctatagcgatggcccccaac

下游引物ds△9-des-r：gcaatctcagagggagcctg。

本发明的积极有益效果：

(1)本发明首次发现△9-desaturase基因参与了中黑盲蝽信息素的合成过程，沉默△9-desaturase基因后中黑盲蝽信息素的主要组分之一(e)-4-oxo-2-hexenal含量显著增高，改变了中黑盲蝽信息素组分的混合配比，最终导致雌虫对雄虫的引诱能力下降。

(2)由于许多盲蝽科昆虫均含有(e)-4-oxo-2-hexenal这一信息素组分(在线数据统计,thepherobase,http://www.pherobase.com,)，该基因可用于开发防治多种盲蝽科昆虫产品。

(3)本发明提供了一种中黑盲蝽△9-desaturase基因的干扰序列，该序列可显著抑制△9-desaturase基因的表达，可利用△9-desaturase基因对中黑盲蝽性信息素交流系统的调控作用，控制其种群的发展，可用于开发绿色环保的抗虫植物，最终达到绿色防治害虫的目的。

(4)利用基因工程技术，可以将外源基因导入植物表达的载体，将可以干扰正常表达的基因导入植物细胞，可以获得抗虫的转基因细胞和转基因植株。

附图说明

序列表seqidno：1是中黑盲蝽△9-desaturase基因的核苷酸序列，序列全长为1077bp。其中该序列的1-1077bp是该基因的编码区。

序列表seqidno：2是中黑盲蝽△9-desaturase基因的蛋白质序列，编码358个氨基酸残基。

图1：△9-desaturase基因影响中黑盲蝽信息素生物合成的功能验证流程图。

图2：peasy-t1克隆载体结构示意图。

图3：注射△9-desaturase基因的dsrna后，△9-desaturase基因分别在脂肪体(fb)和后胸臭腺(mtg)内的沉默效率。其中“ns”表示无显著差异，“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01。

图4：注射△9-desaturase基因的dsrna后，雌虫对雄虫引诱能力发生变化。附图标记说明：图4中的a图：y型嗅觉仪检测结果；图4中的b图：田间诱捕实验检测结果。其中“*”表示p<0.05；“**”表示p<0.01。

图5：注射△9-desaturase基因的dsrna-后信息素组分滴度发生变化。附图标记说明：图5中的a图：ds△9-desaturase处理组臭腺提取物gc-ms峰图；图5中的b图：dsgfp处理组臭腺提取物gc-ms峰图；图5中的c图：4-氧代-反-2-己烯醛与己酸己酯标样gc-ms峰图；图5中的d图：4-氧代-反-2-己烯醛的定量结果；图5中的e图：己酸己酯的定量结果。其中“ns”表示无显著差异；“*”表示p<0.05。图中英文缩写含义：“e4o2h”表示4-氧代-反-2-己烯醛，“hh”表示己酸己酯。图5中a,b和c图中标注数字表示含义：“1”表示4-氧代-反-2-己烯醛的离子峰，“2”表示内标物异丁酸叶醇酯的离子峰，“3”表示己酸己酯的离子峰。

具体实施方式

下面实施例中所使用的技术，包括rna的提取、cdna合成，pcr扩增与检测，dna以及dsrna产物的纯化等分子生物学技术，除非特别说明，均为本领域内技术人员已知的常规技术。所使用的仪器设备、试剂等，除非本说明书特别注明，均为本领域技术人员可通过公关途径或商业途径获得。

实施例中所用试虫(中黑盲蝽)均为处女虫。为本领域常规方法获得。

实施例1：中黑盲蝽△9-desaturase基因的克隆与分析

1.中黑盲蝽总rna的提取：称取30mg的中黑盲蝽样品置于玻璃匀浆器中，利用promega公司的svtotalrnaisolationsystem提取试剂盒提取总rna，详细步骤参照试剂盒说明书。

2.cdna的合成：使用宝生物工程大连有限公司的primescripttmrtmastermix反转录mrna合成cdna模板(详细步骤参照宝生物工程大连有限公司提供的说明书)。

3.引物设计：利用转录组测序得到△9-desaturase基因核酸序列(见seqidno：1)，设计引物验证预测的开放阅读框。设计并合成如下引物：

上游引物序列△9-des-f：5'-cgggcatccgagatttcac-3'；

下游引物序列△9-des-r：5'-acagagcaagaacggtggtg-3'

以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

4.pcr扩增：利用上述引物△9-des-f和△9-des-r进行pcr扩增，pcr体系参照宝生物工程大连有限公司的extaq酶使用说明书。pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用axygen公司的的dna凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。

5.pcr产物的克隆：利用transgen公司的的peasy-t1simplecloningkit，按照说明书将pcr产物连接到peasy-t1载体(见图2)上，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆子送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

6.序列分析：将测序所得的△9-desaturase基因核苷酸序列与转录组测序所得的核苷酸序列比对验证其正确性，结果显示，两次测序结果一致。利用expasy(http://web.expasy.org/translate/)预测并分析该基因的蛋白序列(见seqidno：2)，结果显示，△9-desaturase基因开放阅读框架全长1077bp，编码358个氨基酸残基，预测分子质量为77.6949kd，理论等电点为6.77。本发明进一步将其与半翅目其它5条△9-desaturase氨基酸序列进行比对，确认本发明分离的蛋白具有典型的△9-desaturase蛋白特征。

实施例2：dsrna合成

1.dsrna模板的制备：

(1)根据实施例1中所获得的△9-desaturase基因序列，通过sidirectversion2.0预测dsrna区域，并利用软件primerpremier5.0设计特异性扩增引物(5'-端加上t7promoter序列)，用于△9-desaturase基因的dsrna片段的扩增，设计的特异性引物如下：

上游引物序列ds△9-des-f：ctatagcgatggcccccaac

下游引物序列ds△9-des-r：gcaatctcagagggagcctg

利用上述引物ds△9-des-f和ds△9-des-r进行pcr扩增，pcr反应体系参照宝生物工程大连有限公司的extaq酶使用说明书。

pcr反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃复性延伸2min，38个循环；72℃延伸10min。扩增完毕后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶并利用axygen的dna凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段。最后通过ta克隆将其连接到peasy-t1载体上。

(2)利用axygen的axyprepplasmidminiprepkit试剂盒提取含有目的片段的质粒，以该质粒为模板，利用上述特异性引物ds△9-des-f和ds△9-des-r进行第二次pcr扩增，pcr体系和反应程序同上述①。

2.dsrna模板的纯化

将第二次pcr的产物利用酚氯仿抽提法纯化，具体操作步骤如下：

(1)将需要纯化的材料用depch2o定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。

(2)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，充分震荡后，室温，12000rpm，离心10min。

(3)取上层相(约250μl)，置于新的无rna酶1.5ml离心管中加入1/10体积(25μl)的3m乙酸钠(ph5.2)和2倍体积(约550μl)的无水乙醇(-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃沉淀3h。

(4)4℃，12000rpm，离心15min，弃上清液。

(5)加入75％乙醇(用depch2o配制，-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。

(6)4℃，7500rpm，离心5min。

(7)弃上清液，风干沉淀，加入20μldepch2o溶解沉淀。

(8)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测回收产物，并用nanodrop2000检测产物浓度和od值。

3.dsrna合成：

(1)dsrna合成反应体系

dsrna的合成反应体系见表1。

表1dsrna合成反应体系

轻弹混匀，瞬时离心。37℃，4小时。

(2)dnasei消化dna模板，按照比例加入如表2所述的试剂。

表2dnasei消化反应体系

充分混匀，瞬时离心，37℃，30min。

4.dsrna纯化：

(1)将需要纯化的材料用depch2o定容至300μl(可根据实际需要等比例扩大体系)。

(2)加入150μl的水饱和酚和150μl氯仿，充分震荡后，4℃，12000rpm，离心15min。

(3)取上层相(约250μl)，置于新的无rna酶1.5ml离心管中加入1/10体积(25μl)的3m乙酸钠(ph5.2)和2.5倍体积(约700μl)的无水乙醇(-20℃预冷)，温和混匀后放于-20℃静置过夜。

(4)4℃，12000rpm，离心30min，弃上清液。

(5)加入75％乙醇(depch2o配制，-20℃预冷)上下颠倒数次，洗涤沉淀。

(6)4℃，7500rpm，离心5min。

(7)弃上清液，风干沉淀，加入20μldepch2o溶解沉淀。

(8)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dsrna质量，并用nanodrop2000检测产物浓度和od值。

(9)将dsrna稀释成10μg/μl备用。

实施例3注射ds△9-desaturase后基因的沉默效率及其对中黑盲蝽信息素合成的影响

以合成的dsgfp为对照，利用显微注射仪，将合成的dsrna从中黑盲蝽后胸与腹部节间膜的最外侧注射入新羽化雌虫体内。

分别取注射后3、5、7、10天处理中黑盲蝽的脂肪体与后胸臭腺组织，提取总rna，利用宝生物工程大连有限公司的premixextaq^tmii和bio-raddetectioniq2system.检测△9-desaturase基因的沉默效应。

注射处理7天后，每5头处理中黑盲蝽雌虫为一组味源，以dsgfp为对照组，利用y型嗅觉仪检测中黑盲蝽雌虫对中黑盲蝽雄虫引诱能力的变化。

注射处理7-10天，每3头处理中黑盲蝽雌虫为一组味源，以dsgfp及ck(对照，即无处理)为对照组，利用田间诱捕实验检测中黑盲蝽雌虫对中黑盲蝽雄虫的引诱能力。

注射处理7天后，以10头中黑盲蝽雌虫为一组，以dsgfp为对照组，利用正己烷提取处理中黑盲蝽雌虫后胸臭腺内含物，通过gc-ms分析其中信息素滴度的变化。

试验结果及分析：

(1)注射ds△9-desaturase后基因的沉默效率

qrt-pcr检测结果显示：与dsgfp相比，注射ds△9-desaturase显著抑制了△9-desaturase在脂肪体内的表达(见图3中的b图)。在后胸臭腺中，除了注射后第5天外，注射后3、7、10天靶标基因均显著性下调(见图3中的a图)。由此可见，该中黑盲蝽△9-desaturase基因的干扰序列可干扰△9-desaturase基因的表达。

(2)注射ds△9-desaturase后雌虫对雄虫引诱能力的变化

在实验室内，申请人利用y型嗅觉仪检测8日龄中黑盲蝽雄虫对ds△9-desaturase及dsgfp处理中黑盲蝽雌虫的偏好，结果显示，中黑盲蝽雄虫更趋向于选择dsgfp处理中黑盲蝽雌虫(见图4中的a图)。在田间，申请人以ds△9-desaturase处理、dsgfp处理以及ck处理的中黑盲蝽雌虫为诱芯，统计引诱中黑盲蝽雄虫的数量(见图4中的b图)，结果显示，与dsgfp处理以及无处理的对照相比，ds△9-desaturase处理组引诱的雄虫数量显著下降了，dsgfp处理组与ck处理组之间无显著性差异。由此可见，注射ds△9-desaturase显著抑制了中黑盲蝽雌虫对中黑盲蝽雄虫的引诱能力。

(3)注射ds△9-desaturase对中黑盲蝽雌虫信息素滴度的变化

取注射7天后的中黑盲蝽雌虫，以10头为一组，利用正己烷萃取处理雌虫后胸臭腺内含物。gc-ms分析结果显示，与dsgfp相比，ds△9-desaturase处理组中黑盲蝽雌虫后胸臭腺中4-氧代-反-2-己烯醛的含量显著增加，而另一信息素组分己酸己酯的含量则无明显变化(见图5)。由此可见，抑制△9-desaturase基因的表达，改变了其信息素组分4-氧代-反-2-己烯醛的含量，最终影响了中黑盲蝽雌虫对中黑盲蝽雄虫的引诱能力。因此本发明提供的rna干扰序列可应用于转基因抗中黑盲蝽植物的开发。进一步开发其蛋白可应用于中黑盲蝽的生物防治。

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