本发明属于酶工程领域，特别涉及一种重组蔗糖磷酸化酶在制备功能性低聚糖中的应用。
背景技术：
蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7)(spase)属于糖苷水解酶13家族[1]，在磷酸缓冲液中能催化分解蔗糖形成α-d-葡萄糖-1-磷酸(glc-1-p)和d-果糖[2]，并将glc-1-p中的葡萄糖基转至糖类，糖醇[3]，酚类和醇类化合物[4]形成新的糖苷类化合物[5]。已报道spase存在于肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)[6]，嗜糖假单胞菌(pseudomonassaccharophila)[7]，腐败假单胞菌pseudomonasputerfaciens[8]，变异链球菌streptococcusmutans[9]和青春双歧杆菌bifidobacteriumadolescentis[10]等微生物中，而spase基因克隆也有了相关的报道[11]。
应用其催化特性，蔗糖磷酸化酶能以果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等为受体，催化合成相应的多一个葡萄糖基团的低聚糖[12]。低聚糖是由2～10个单糖(相同或不同)通过糖苷键(支链或直链)聚合而成的一大类糖，具有糖类的特性，可直接作为配料添加到食品中，有预防龋齿功能，不被胃酸和内源性消化酶降解，不被(或难被)小肠吸收[13]，具有促进双歧杆菌增殖[14]，提高机体免疫力[15]等生理功能的一大类糖。在全球性的保健品热潮中，低聚糖由于其功能的多样性和独特性，作为一种功能性食品基料而受到消费者的青睐，这刺激了新型低聚糖的研究和开发。2001年，trujillo等报告了利用酵母工程菌发酵生产果糖基转移酶，该酶可将蔗糖底物的70％转化蔗果三糖[16]。管立忠等利用黑曲霉中α-葡萄糖苷酶合成低聚异麦芽糖[17]，drouillard等利用大肠杆菌高效表达来源于发光杆菌(photobacteriumsp.jt-ish-224)的α-2,6唾液酸转移酶合成唾液酸化乳糖[18]。其中spase因其广泛的受体范围，也被较多利用来合成低聚糖[19]，所合成的蜜二糖除了能直接做为低聚糖，也可用来合成更高聚合度的低聚糖[20]。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种重组蔗糖磷酸化酶在制备功能性低聚糖中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种重组蔗糖磷酸化酶在制备功能性低聚糖蜜二糖中的应用。
所述的重组蔗糖磷酸化酶利用蔗糖和d-半乳糖为底物合成功能性低聚糖蜜二糖。
所述的蜜二糖的合成最佳条件为初糖浓度为60％，初糖摩尔比例蔗糖：d-半乳糖为1:2，反应温度为40℃，加纯化重组蔗糖磷酸化酶的终浓度为0.39u/ml的条件下反应24h，可得到蜜二糖的量为34.20±0.92g/l。
所述的重组蔗糖磷酸化酶的制备方法，包括如下步骤：
克隆蔗糖磷酸化酶(spase)基因，并构建大肠杆菌重组菌株，诱导表达产生可溶性spase，纯化，透析除盐后获得spase纯化酶，即重组蔗糖磷酸化酶；
所述的蔗糖磷酸化酶基因是从芒果源肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)mpl1中克隆得到的。
所述的大肠杆菌为大肠杆菌bl21。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本文旨在建立利用重组酶spase发酵制备蜜二糖的适宜条件，通过构建了重组菌株发酵生产spase，并对其进行分离纯化以及酶学性质的研究，此外还利用该酶以d-半乳糖和蔗糖为底物催化合成蜜二糖，优化了其合成条件，为进一步利用功能性低聚糖打下基础。
附图说明
图1是spase基因克隆和表达质粒鉴定；其中，泳道m：marker；泳道1：pcr产物；泳道2：pet-32a-spase双酶切。
图2是spase蛋白的sds-page分析结果；其中，泳道m：marker；泳道1：破碎上清；泳道2～5：漂洗收集液；泳道6～8：洗脱收集液。
图3是温度和ph对酶活和稳定性的影响；其中，图a：温度对酶活的影响；图b：ph对酶活的影响；图c：温度对酶活稳定性的影响；图d：ph对酶活稳定性的影响。
图4是蔗糖与d-半乳糖反应的结果；其中，图a中峰1：蜜二糖标品；图b中：1：溶剂峰；2：1-磷酸葡萄糖；3：果糖；4：d-半乳糖；5：蔗糖；6：蜜二糖；7：未知糖。
图5是蔗糖与麦芽糖反应的结果；其中，1：溶剂峰；2：1-磷酸葡萄糖；3：果糖；4：麦芽糖；5：蔗糖；6：新合成低聚葡萄糖。
图6是合成条件的影响；其中，图a：底物浓度的影响；图b：底物比例的影响；图c：反应温度的影响；图d：加酶量的影响。
图7是合成时间对蜜二糖产量的影响。
图8是响应面设计优化低聚糖合成条件。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒
乳酸菌菌株：芒果源肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)mpl1，从芒果中分离筛选所得(在文献“芒果源高降胆固醇乳酸菌的特性及其作用机制[j].中国食品学报,2016,16(5)：10-18.”中公开)。克隆菌株大肠杆菌(e.coli)dh5α和表达菌株大肠杆菌bl21，表达载体pet-32a(+)，均购自takara。pmd18-t购于takara。
1.1.2试剂
琼脂糖凝胶dna纯化试剂盒、质粒快速提取试剂盒为tiange公司产品。限制性内切酶酶、taqdna聚合酶、t4dna连接酶、dnamarker和蛋白质marker于takara公司购买。其他一般试剂均为进口或国产分析纯。spase酶活测试试剂盒购于科铭生物公司。
1.2方法
1.2.1蔗糖磷酸化酶基因的克隆
从genbank数据库查找肠膜明串珠菌spase序列(jauj01000007.1，1479bp)进行引物设计，f：5'-cggaattcatggaaattcaaaataaagc-3'；r：
5'-ttgcggccgcttacaattgttg-3'。以提取的芒果源肠膜明串珠菌的基因组dna为模板进行pcr扩增，体系为50μl。程序为:94℃，5min；94℃，30s；48℃，30s；72℃100s；循环35次，72℃，10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。回收目的片段，将片段与质粒pmd18-t连接。连接产物转化至大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞，菌液涂布与lb固体平板上(含amp+100μg/ml)。37℃培养15h后挑取单菌落，验证阳性克隆。将阳性克隆送至测序。
蔗糖磷酸化酶的核苷酸测序结果如seqidno：3所示，长度为1479bp。
编码的氨基酸序列如seqidno：4所示。
1.2.2大肠杆菌重组表达载体构建
将阳性克隆载体和表达载体pet-32a(+)双酶切，分别回收目的基因片段和载体框架，用t4dna连接酶按1：8的比例连接16h，产物转化大肠杆菌bl21感受态细胞。通过筛选与鉴定，获得重组菌株bl21/pet32a-spase。
1.2.3重组大肠杆菌的诱导表达
将鉴定正确的重组菌株bl21/pet32a-spase，涂布到lb固体平板上，37℃培养过夜，挑单菌落接种于50mllb液体培养基中，37℃过夜培养，按1：100的比例接种到50ml含amp+的lb液体培养基中，37℃培养2.5h，使菌液od值达到0.8，加入iptg至终浓度为1mm，30℃诱导表达3h，离心收集菌体，破碎，进行sds-page电泳分析，并对上清进行spase酶活测定。brandford法测定蛋白质含量。
1.2.4重组spase酶的纯化
发酵液离心(4℃，8000r/min，15min)得到的菌泥用0.5mol/l磷酸钾缓冲液(ph6.5)洗涤并浓缩。浓缩后的菌液经高压破碎后离心(4℃，12000r/min，30min)得到的上清液即为粗酶液。粗酶液经镍nta琼脂糖凝胶色谱柱，采用含250mmol/l咪唑的磷酸缓冲液洗脱，洗脱液用截留分子量为10kda的超滤离心管离心脱除咪唑，得到纯酶液。brandford法测定蛋白质含量。试剂盒进行spase酶活测定。
1.2.5重组spase酶最适反应温度
将纯化的重组spase置于ph6.4缓冲液中，在不同的温度(30℃～80℃)下测定酶活，以活力最高者为100％对照。
1.2.6酶的最适ph的测定
经纯化的重组spase在30℃条件下，在不同的ph(4.0～10.0)缓冲液中测定酶活，以活力最高者为100％对照。
1.2.7酶的温度稳定性的测定
将纯化的重组spase置于ph6.4缓冲液中，在不同的温度(20℃～45℃)下保温2h，然后测定其剩余酶活。以活力最高者为100％对照。
1.2.8酶的ph稳定性的测定
将纯化的重组spase置于不同的ph(5.5～8.0)的磷酸缓冲液下，35℃保温2h，然后测定其剩余酶活。以活力最高者为100％对照。
1.2.9合成底物的筛选
称取0.3g蔗糖和0.3g单糖(麦芽糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、d-乳糖、d-半乳糖)放入螺口瓶中，加入1ml的pbs(50mm，ph6.0)调整浓度至60％(w/v)，并在37℃保温10min，使糖固体完全的溶解并混匀。按加入100μl的纯化酶并放入37℃水浴锅开始反应，反应5h后放入沸水浴中煮沸10min灭酶。样品经离心(10000rpm，10min)收集上清液，微孔滤膜过滤后，用hplc法测定各种糖的含量。采用hplc法分析酶促反应产物。
1.2.10以d-半乳糖和蔗糖为底物合成低蜜二糖
糖标准溶液的制备：用pbs(50mm，ph6.0)将d-半乳糖、d-果糖、蔗糖、蜜二糖配制成10mg/ml标准溶液，经微孔滤膜过滤后进行hplc检测。根据糖类物质在hplc上的峰面积，采用面积归一化法计算低聚糖的浓度和产量。
1.2.11蜜二糖合成条件的影响
将底物分别按不同的底物浓度(30％、40％、50％、60％、70％)，蔗糖：d-半乳糖＝1:1，37℃下反应5h，检测合成产物；取底物浓度60％，按不同的比例(蔗糖：d-半乳糖＝4：1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6)37℃下反应5h，检测合成产物；取底物浓度60％和比例为1:1，在20、30、40、50、60℃下反应5h，检测合成产物。取浓度60％、比例1:1和反应温度37℃，分别加入纯酶液30、50、100、200、400、600μl，反应5h，检测合成产物。取上述各合适条件，反应40h，每2h检测一次含量。反应均于50mm，ph6的pbs缓冲和中进行。产物进行高效液相色谱(hplc)检测。检测条件：色谱柱为welchultimate氨基柱，rid-10a示差折光检测器，流动相为75％乙腈，柱温40℃，流速为1ml/min。
1.2.12时间对蜜二糖合成的影响
取上述各合适条件，反应40h，每2h检测一次产物含量。
1.2.13响应面设计优化低聚糖合成条件
根据mydesign中心组合设计原理，在单因素试验的基础上，以初始糖浓度、糖比例和温度三个因素为自变量，蜜二糖含量为响应值，做三因素三水平的响应面分析试验。
2结果与分析
2.1spase基因的克隆与表达载体的构建
以上述的引物，通过pcr扩增spase基因，1％琼脂糖凝胶电泳，结果分别如图1中泳道1所示，显示长度约为1500bp的单一dna条带，与设计的目的片段长度都相符。连接pmd18-t构成的克隆质粒pmd-18t-spase，将其和质粒pet-32a同时进行双酶切，回收片段连接后酶切检测，形成泳道2条带，如泳道2所示，结果与目的条带大小一致。spase测序结果显示无突变，表明spase表达重组载体构建成功，为重组质粒pet32a-spase。
2.2重组大肠杆菌spase的诱导表达与纯化
将成功构建的重组质粒pet32a-spase转入e.colibl21中，挑取单菌落摇瓶诱导培养。收集菌体破碎离心取上清，上清经聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)，结果如图2。spase蛋白预测大小分别为56.1kda，加上6个his标签，大小约为63kda，与图2中条带大小相符。经镍nta琼脂糖凝胶色谱柱纯化后，即可得到纯酶液。brandford法测定纯化前后的蛋白质含量分别为24.84mg/ml和12.52mg/ml，纯化比例达到50.42％。试剂盒测得纯化前后比酶活分别为0.042u/mg和0.078u/mg。这里所测得比酶活相对较低，和测量方法和酶活定义有关。
2.3温度和ph对spase酶活和稳定性的影响
ph和温度对酶活力和稳定性的影响结果如图3。结果表明，酶的最适反应温度为40℃；当温度在20℃～40℃间，酶活都比较稳定，仍能保持90％以上的活力，温度超过40℃后，酶活力损失增加。酶的最适作用ph为6；随着ph的改变，酶活都有所下降，但在ph6.0～7.0下活力还是能维持在85％以上。
2.4spase合成功能性低聚糖底物的筛选
将麦芽糖、木糖、鼠李糖、d-半乳糖、d-乳糖、阿拉伯糖、甘露糖分别与蔗糖进行反应，底物浓度为60％，底物比例为1:1，在30℃下反应5h，产物经高效液相色谱检测，结果如图4和图5所示。其中d-半乳糖和麦芽糖可明显产生低聚糖，而其他单糖均未检测出新的糖类产生(图未附)。其中与d-半乳糖反应除了生成蜜二糖，还有另一种糖生成如峰7显示，需做进一步的测定。
2.5功能性低聚糖合成条件的影响
功能性低聚糖合成条件结果如图6。当底物浓度达到50％时，蜜二糖产量最高，随着浓度的增加，产量下降。底物浓度过低，导致spase将葡萄糖基转化到水分子上，发生水解作用[25]，但当底物浓度过高时，糖底物不能完全溶解，无法与酶充分接触。当底物初始比例为1:1时，蜜二糖产量最高，说明该比例条件下，酶与两种底物的总亲和能力达到最大。蜜二糖合成的最适温度为30℃，虽然酶的最适反应温度为40℃，且有利于糖的完全溶解，但随着温度的升高，酶稳定性也逐渐降低。选择底物浓度为50％，比例为1:1，合成温度为30℃，当纯酶液为400μl时产量达到16.2±0.31g/l，即为酶活0.39u，随着酶浓度的逐渐增加，产量也随之增加，当超过400μl时，增加幅度趋于平稳。
2.6合成时间对蜜二糖产量的影响
当合成条件为底物浓度为50％，比例为蔗糖：d-半乳糖＝1:1，30℃下反应，每2h测量一次产量，结果如图7所示。随着时间增加，产量也随之增加，当达24h时达到最大29.22±0.41g/l。超过24h时虽有所增加，但增加率较小，因此将反应时间控制在24h。
2.7响应面设计优化低聚糖合成条件
以蜜二糖的产量为响应值作正交分析结果如图8，结果显示a、b、c、ac对蜜二糖的产量是极为显著的；而a2、c2是显著的(a：初糖浓度；b：初糖比例；c：温度，f＜0.05为显著；f＜0.01为极显著)。由响应面的模型分析预测所得，蜜二糖的合成最佳条件为初糖浓度为60％，初糖比例为1:2，反应温度为40℃，预测的最高产量可为35.773g/l，故在此条件基础上，添加纯化酶液400μl，反应24h，对最优合成工艺进行验证。但由于原液相仪器损坏后进行了更换，测得生成的量普遍偏小，最大生成量取为34.20±0.92g/l，与最高产量相差较小，故该模型同样具有实际参考应用价值。
3结论
功能性低聚糖的因其功能的多样和独特性受到研究者的青睐。本文从筛得的肠膜明串珠菌中克隆得到spase基因，并构建大肠杆菌重组菌株进行表达，对该酶的酶学性质进行了研究，并用以合成功能性低聚糖。目前合成功能性低聚糖的方法有化学合成[21]和生物酶法合成，前者价格昂贵且难以合成结构复杂的低聚糖，后者因酶结构和产物特异性而被广泛的利用。利用的较多生物酶类有糖基转移酶[22]，核苷酸底物，价格较贵，糖苷水解酶[23]具有水解糖苷活性，合成量有一定限度，糖苷合成酶[24]其缺点糖苷键过于单一无法形成新型低聚糖。而spase可同时以1-磷酸葡萄糖和蔗糖为糖基供体时，增加了受体的范围[25]，使其得到了更广泛的应用。本文研究开始分别将麦芽糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖与蔗糖为底物，但仅麦芽糖和d-半乳糖有明显的低聚糖生成，这与其他来源的spase受体活性存在一定的差异。已有报道表明的不同来源的spase受体特异性差异较大相一致[25]。以蔗糖和d-半乳糖为底物合成蜜二糖，合成条件的单因素实验与响应面分析显示合成最佳条件为初糖浓度为60％，初糖比例为1:2，反应温度为40℃，可得到蜜二糖的量为34.20±0.92g/l。工业上获得蜜二糖一方面可水解棉子糖产生蜜二糖和果糖，另一方面可分离植物低聚糖组获得[26]，
未有明确数据进行对比。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。