本发明属于动物病毒学与动物传染病学技术领域。具体涉及猪德尔塔冠状病毒株的分离、灭活疫苗的制备与应用。
背景技术：
猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,pdcov)是一种新发现的猪肠道冠状病毒，可引起仔猪发生腹泻疾病。2011年，香港学者在对禽类和哺乳类动物进行分子流行病学调查时首次在猪粪便中检测到pdcov，但是对其致病性并未进行深入研究(woo,p.c.,etal.,discoveryofsevennovelmammalianandaviancoronavirusesinthegenusdeltacoronavirussupportsbatcoronavirusesasthegenesourceofalphacoronavirusandbetacoronavirusandaviancoronavirusesasthegenesourceofgammacoronavirusanddeltacoronavirus.jvirol,2012,86(7):3995-4008)。在2014年2月，美国俄亥俄州部分猪场发生大规模的腹泻疾病，检测结果显示pdcov为阳性，而且随后的动物回归实验证实pdcov确实可以在仔猪中引起严重腹泻(wang,l.,etal,detectionandgeneticcharacterizationofdeltacoronavirusinpigs,ohio,usa,2014.energinfectdis,2014,20(7):1227-1230；jungetal.,pathogenicityof2porcinedeltacoronavirusstrainsingnotobioticpigs.energinfectdis,2015,21(4):650-654)。鉴于腹泻疾病对美国猪养殖业的影响严重，2014年6月5日，美国农业部发布联邦政令，设立了包括pedv、pdcov在内的致腹泻肠道冠状病毒病例报告机制，并拨款2620万美元以用于相关检测防治工作(www.aasv.org)。目前美国、加拿大、韩国、墨西哥、泰国、老挝等国家陆续报道了pdcov的出现(lee,j.h.,etal.,detectionandphylogeneticanalysisofporcinedeltacoronavirusinkoreanswinefarms,2015.transboundemergdis,2016,63(3):248-252；wang,l.,etal,porcinecoronavirushku15detectedin9usstates,2014.energinfectdis,2014,20(9):1594-1595；homwong,n.,etal.,characterizationandevolutionofporcinedeltacoronavirusintheunitedstates.prevvetmed,2016,123:168-74；janetanakit,t.,etal.,porcinedeltacoronavirus,thailand,2015.energinfectdis,2016,22(4):757-759；lorsirigool,a.,.etal,thefirstdetectionandfull-lengthgenomesequenceofporcinedeltacoronavirusisolatedinlaopdrarchvirol,2016,161:2909)。最近国内不同的研究单位也相继报道了pdcov在中国不同省份的流行，总阳性率可以达到30％左右，而且pdcov与猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)共感染的情况比较普遍(chen,f.,etal.,full-lengthgenomecharacterizationofchineseporcinedeltacoronavirusstrainch/sxd1/2015.genomeannouncements,2015,3(5)；song,d.,etal.,newlyemergedporcinedeltacoronavirusassociatedwithdiarrhoeainswineinchina:identification,prevalenceandfull-lengthgenomesequenceanalysis.transboundemergdis,2015,62(6):575-580；dong,n.,etal.,porcinedeltacoronavirusinmainlandchina.energinfectdis,2015,21(12):2254-2255.)。
pdcov感染仔猪后可以引起典型的肠道疾病，主要症状为呕吐、腹泻，并伴随有食欲下降和精神倦怠等(ma,y.,etal.,origin,evolution,andvirulenceofporcinedeltacoronavirusesintheunitedstates.mbio,2015,6(2):e00064；hu,h.,etal.,isolationandcharacterizationofporcinedeltacoronavirusfrompigswithdiarrheaintheunitedstates.jclinmicrobiol,2015,53(5):1537-1548)。目前的人工感染动物实验证实本病毒对5日龄-21日龄的仔猪均具有致病性，且随着仔猪日龄的增加病毒引起的症状逐渐减轻，另外最近泰国的临床报道显示本病毒同样可以在母猪和育肥猪中引起严重的腹泻，并且导致死亡(janetanakit,t.,etal.,porcinedeltacoronavirus,thailand,2015.energinfectdis,2016,22(4):757-759)。pdcov感染后的猪肠道可以产生以肠上皮细胞肿大和空泡化为主的典型病变，而且病变主要在空肠和回肠，人工感染的仔猪可以通过粪便排毒2周以上，具有较强的传染性。
目前针对猪肠道冠状病毒如pedv,tgev的防治主要是依靠灭活疫苗和致弱活疫苗的免疫保护。而当前对于新发生的猪德尔塔冠状病毒还没有特别有效的防治方法，因此pdcov疫苗的研制迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于针对现有背景技术中所述问题，提供一株免疫原性较强的猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,简称pdcov)分离株。
本发明第二个目的在于提供一个猪德尔塔冠状病毒制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗。
本发明的第三个目的在于提供猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗的应用。
实现本发明的技术方案如下所述：
本发明从河南省某发病猪场病料中分离得到一株候选病毒株，鉴定后命名为猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoroanvirus)简称pdcov，申请人将该毒株命名为猪德尔塔冠状病毒chn-hn-2014株，porcinedeltacoroanviruschn-hn-2014株，于2016年9月13日送检中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：cctccno:v201650。该毒株全基因组序列已经提交至genbank数据库，genbank检索号为kt336560.1。
生物学功能验证试验表明，本发明的pdcovchn-hn-2014株接种llc-pk1细胞后能够产生典型细胞病变，且在llc-pk1细胞上增殖稳定，病毒滴度达108.0tcid50/ml以上。
将pdcovchn-hn-2014株在llc-pk1细胞上进行扩大增殖，收集病毒液，加入终浓度为0.1％的甲醛进行灭活，将灭活好的抗原与montanideisa201(seppic)佐剂按照质量比为1：1进行混合并乳化制备得到猪德尔塔冠状病毒(pdcov)灭活疫苗。
本发明的积极效果在于：
(1)本发明的猪德尔塔冠状病毒chn-hn-2014株制备的灭活疫苗具有良好的安全性能，不会引起免疫仔猪的不良反应。
(2)本发明猪德尔塔冠状病毒chn-hn-2014株制备的灭活疫苗具有较好的免疫原性，仔猪免疫本发明的疫苗后可以在21天产生较高水平的血清中和抗体。
(3)本发明的猪德尔塔冠状病毒chn-hn-2014株制备的灭活疫苗免疫仔猪后能够保护仔猪免受猪德尔塔冠状病毒的攻击，保护率可达80％以上。
(4)本发明的猪德尔塔冠状病毒chn-hn-2014株应用范围较宽，既可以制成单苗也可以与其他抗原组合制备成联苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步对本发明进行解释，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并能予以实施，但实施例并不作为对本发明的限定。
实施例1：猪德尔塔冠状病毒pdcovchn-hn-2014株的获得
1.病料的采集与处理：
从中国河南省某猪场送检的出现严重腹泻疾病的仔猪，采集小肠内容物，用10倍体积dmem培养基将内容物稀释，充分匀浆震荡，4℃4200×g离心10分钟，取上清液用0.45微米微孔滤膜过滤除菌后作为接种液冻存于-70℃备用。
2.病料rt-pcr检测：
取步骤1中所得的接种液200微升，用trizol法(试剂盒购自宝生物工程大连有限公司，按照试剂盒说明书操作)提取总rna，使用rnapcrkit将提取的总rna反转录为cdna后进行pcr扩增，pcr上下游引物分别为f：tttcaggtgctcaaagctcar：gcgaaaagcatttcctgaac，pcr体系为10×buffer5μl、dntps(10mm)1μl、上游、下游引物各1μl、taqdna聚合酶0.5μl、cdna1μl、ddh2o40.5μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min后进入循环：95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环后72℃延伸5min。pcr扩增时设立ddh2o作为阴性对照。pcr反应结束后，取10μlpcr产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，发现阳性样品在694bp处有一条特异性条带。将检测为pdcov阳性的样品进行其他常见腹泻病原的检测(如猪伪狂犬病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)等)，检测结果pdcov为阳性，其他病原阴性的样品进行后续的病毒分离。
3.病毒分离与传代：
将llc-pk1细胞接种6孔细胞培养板，细胞长至单层后吸弃细胞生长液，加入含10μg/ml胰酶的dmem维持液(来源公司)2ml，再加入步骤2中检测为pdcov阳性的接种物20μl，感作1小时后换入新的含10μg/ml胰酶的dmem维持液，置37℃含5％co2的培养箱培养。待细胞出现显著病变后(约24-36小时)收取病毒液，从收取的病毒液中分离得到猪德尔塔冠状病毒pdcovchn-hn-2014株。
4.pdcovchn-hn-2014株序列测定
(1)pdcov病毒rna的提取及cdna制备
取冻融的pdcovchn-hn-2014毒液200μl至1.5ml离心管，每管加入1ml
(2)pdcovchn-hn-2014株全基因组测序
以步骤(1)中制备的cdna为模版，用下列16对引物扩增病毒全基因组序列
(3)基因片段pcr扩增反应条件：95℃预变性5min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸2.5min的程序，34个循环；72℃延伸10min。将各个片段的pcr产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳回收，按照常规ta克隆后进行测序，各片段拼接后得到pdcovchn-hn-2014株全基因组序列，该基因组序列已经提交至genbank数据库，genbank检索号为kt336560.1。
实施例2：猪德尔塔冠状病毒chn-hn-2014株在制备猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗中的应用：
1.取pdcovchn-hn-2014株(保藏编号：cctccno:v201650)接种于llc-pk1细胞(购自atcc细胞库，美国)，细胞病变后将细胞冻融2次收集病毒液，按照常规tcid50测定方法测定病毒滴度，并将病毒含量调整至108.0tcid50/ml，经过终浓度为0.1％的甲醛灭活后与相同质量的montanideisa201(购自seppic公司，法国)佐剂混合，无菌条件下充分搅拌混合并乳化，乳化温度为31℃，乳化时间为15分钟，乳化完全后做无菌分装，密封保存备用。
(1)猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗安全检验
试验方法：选取6头3-5日龄健康仔猪，每头仔猪肌肉注射本发明制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗2ml，注射后饲养观察14天，观察结果显示，免疫后仔猪精神状态、体温、食欲、排便等均正常，疫苗注射部位无肿胀坏死等不良反应。
(2)猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗免疫效力试验：
试验方法：将pdcov血清中和抗体不高于1:4母猪所产3～5日龄健康仔猪10头分为2组，每组5头，其中一组经肌肉注射1ml疫苗进行免疫，另一组作为阴性对照，免疫后7天、14天、21天分别采血，分离血清，测定pdcov中和抗体。在采血完成后每头仔猪口服10mlpdcovchn-hn-2014株病毒液(108.0tcid50/ml)，攻毒后连续观察7天。
中和抗体检测结果：由pdcovchn-hn-2014株制备的灭活疫苗免疫仔猪后21天可以产生较高水平的pdcov中和抗体(表1)，证明本发明制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗具有较好的免疫原性。
表13～5日龄仔猪免疫后中和抗体检测结果
攻毒结果：灭活疫苗免疫仔猪在pdcov强毒攻击后仅有一头出现轻微腹泻，并且很快恢复，其余4头猪在整个观察期内未出现任何不良反应，说明pdcovchn-hn-2014株制备的灭活疫苗能有效保护免疫猪抵抗pdcov强毒的攻击，保护率达到80％，而对照组全部发病(见表2)。
表2猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗免疫后攻毒试验结果
由表1和表2的结果所知，pdcovchn-hn-2014株制备的猪德尔塔冠状病毒灭活疫苗具有较好的免疫原性，21天后免疫猪能够产生较高水平的血清中和抗体，为免疫猪群提供较好的保护。