一株利用D‑木糖生产D‑1,2,4‑丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

d-1,2,4-丁三醇(d-1,2,4-butanetriol，简称bt)是一种重要的四碳多元醇，无色、无味、透明的溶于水是粘稠糖浆类液体。其性质和丙三醇(甘油)类似，具有一定的吸湿性和稳定性。d-1,2,4-丁三醇及其衍生物是许多化合物的重要的底物及合成的前体。在军事上丁三醇可以用来合成丁三醇三硝酸酯(bttn)，它是一种高效的推进剂和增塑剂。在医药上，能合成降胆固醇的药物movinolin、抗癌药物、还可以用于治疗艾滋病药物agenerase(一种hiv蛋白酶抑制剂)。在烟草行业，可以作为卷烟添加剂，可以降低焦油对人体的伤害。另外，d-1,2,4-丁三醇还可以用于高级服装的处理，以及抑菌剂和高分子交联剂等。

目前丁三醇的生产主要采用nabh4还原苹果酸二酯或铷和碳催化苹果酸加氢等相关方法使用不同的催化剂在19.7-34.0mpa的h2压力下和60-160℃的条件下，可将苹果酸以60％-80％的转化率转化为1,2,4-丁三醇。然后由于化学合成法存在原料成本高、产物转化率低、反应条件严苛、生产危险大、副产物多、环境污染严重等问题，随着近年来生物技术的发展以及1,2,4-丁三醇市场的快速增长，人们开始关注原料成本低廉、反应条件温和、对环境友好且安全高效的生物合成1,2,4-丁三醇的技术途径。

weiniu等首次报道了在大肠杆菌(escherichiacoli)中构建了异源代谢途径，随后由e.colidh5α/pwn6.186a(表达了苯甲酰甲酸脱羧酶基因的工程菌)经三步催化反应生成d-bt，摩尔转化率为25％，d-木糖酸和l-阿拉伯糖酸为底物合成1,2,4-丁三醇对映体，产量为2.4g/l。这种方法耗时长，发酵液中其它物质大大增加了生产成本，另外发酵法生产丁三醇摩尔收率较低，耗时较长，反应体系较复杂，产物分离较困难。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一株利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，以解决现有技术中d-1,2,4-丁三醇生产成本高、转化率低的问题。

本发明还要解决的技术问题是提供上述利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在催化生产d-1,2,4-丁三醇中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，其特征在于，在宿主菌中导入了木糖脱氢酶、2-酮酸脱羧酶、木糖酸脱水酶、醛还原酶。d-木糖在d-木糖脱氢酶作用下生成d-木糖酸，之后在d-木糖酸脱水酶作用下生成3-脱氧-d甘油戊酮糖酸，在2-酮酸脱羧酶作用下生成3，4二羟基丁醛，最后在醇脱氢酶作用下生成d-1，2，4丁三醇。

作为优选，所述的木糖脱氢酶的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述的2-酮酸脱羧酶核苷酸序列如seqidno.2所示、所述的木糖酸脱水酶的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述的醛还原酶的核苷酸序列如seqidno.4所示。

上述利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将木糖脱氢酶、2-酮酸脱羧酶、木糖酸脱水酶、醛还原酶克隆到表达质粒中，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转化宿主菌，既得到利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌e.colibl-pmb-pgp。

作为优选，将木糖脱氢酶、2-酮酸脱羧酶同时构建到ptrc-99a质粒上，得到重组质粒a；将木糖酸脱水酶、醛还原酶克隆到pcwj-1质粒上，得到重组质粒b，将重组质粒a和重组质粒b同时转化宿主菌，既得到利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌e.colibl-pmb-pgp。

作为优选，所述的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。

上述利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌在生产d-1,2,4-丁三醇中的应用。

在利用基因工程菌e.colibl-pmb-pgp催化生产d-1,2,4-丁三醇的方法如下：

(a1)将培养基因工程菌e.colibl-pmb-pgp，收集e.colibl-pmb-pgp菌体细胞；

(a2)将e.colibl-pmb-pgp菌体细胞转接到催化体系中，反应，得到d-1,2,4-丁三醇。

步骤(a2)中，所述的催化体系包括如下组分：

nacl0.5g/l，nh4cl10g/l，na2hpo4·12h2o17.1g/l，kh2po43g/l，mgso40.12g/l，cacl21.1×10^-2g/l，(nh4)6mo7o243.71×10^-3g/l，h3bo32.47×10^-2g/l，cocl2·6h2o7.14×10^-3g/l，mncl2·4h2o1.60×10^-2g/l，znso4·7h2o2.8×10^-3g/l，cuso4·5h2o2.51×10^-3g/l，d-木糖10g/l-40g/l，碳酸钙1g/l，mops100mmol/l，tritonx-1000.5g/l，tween-200.5g/l，tween-800.5g/l，sds0.5g/l。

步骤(a2)中，催化反应条件为：温度37℃，搅拌转速200rpm。

有益效果

本发明公开了一株利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌，通过在宿主菌中过表达了木糖脱氢酶(xylb)、2-酮酸脱羧酶(mdlc)、木糖酸脱水酶(yjhg)、醛还原酶(adhp)，实现了d-木糖为底物生产高价值的d-1,2,4丁三醇，解决了体外酶催化d-木糖转化为丁三醇过程中，需要外源添加昂贵辅酶带来的经济问题和发酵法时间长问题，同时，通过调节底物d-木糖浓度来提高产量，实现底物更有效的利用。另外通过调节重组菌e.colibl-pmb-pgpod600比值提高丁三醇的摩尔收率。

附图说明

图1为不同糖浓度对产物产量的影响。1号10g/l木糖，2号20g/l木糖，3号30g/l木糖，4号40g/l木糖。

图2为不同细胞od600对产物产量的影响。1号od600为10，2号为od60020，3号od60030，4号od60040，5号是od60060。

图3不同细胞通透剂对产物产量的影响。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

将来源于大肠杆菌mg1655的木糖酸脱水酶基因(yjhg)和来源于大肠杆菌mg1655醛还原酶基因(adhp)分别插入pcwj质粒，到重组质粒pcwj-yjhg和pcwj-adhp。以pcwj-adhp质粒为模板扩增出带有trc启动子的adhp片段，将该片段插入质粒pcwj-yjhg，得到质粒pcwj-yjhg-trc-adhp。

将来源于恶臭假单胞杆菌的2-酮酸脱羧酶基因(mdlc)插入质粒ptrc99a的ncoⅰ和sacⅰ位点之间，从而获得重组质粒ptrc-mdlc。将来源于新月柄杆菌木糖脱氢酶基因(xylb)基因插入质粒ptrc99a的ncoⅰ和bamhⅰ位点之间，从而获得重组质粒ptrc-xylb。然后通过pcr得到带有trc启动子的xylb片段，将该片段插入质粒ptrc-mdlc的sacⅰ和bamhⅰ位点之间，得到新的重组质粒ptrc-mdlc-trc-xylb。

实施例2：不同糖浓度对产量影响

从平板上挑取重组菌株e.colibl-pmb-pgp的单菌落接种到含有100mg/l氨苄青霉素抗性和68mg/l氯霉素抗性的5mllb摇管里，培养10-12h后转接到含有100mg/l氨苄青霉素抗性和68mg/l氯霉素抗性的100mllb培养基里，再次转接放大培养12-18h离心集菌，得到重组菌株e.colibl-pmb-pgp的细胞。

将细胞收菌用生理盐水洗涤，用m9溶液(nacl0.5g/l，nh4cl10g/l，na2hpo4·12h2o17.1g/l，kh2po43g/l，mgso40.12g/l，cacl21.1×10^-2g/l，(nh4)6mo7o243.71×10^-3g/l，h3bo32.47×10^-2g/l，cocl2·6h2o7.14×10^-3g/l，mncl2·4h2o1.60×10^-2g/l，znso4·7h2o2.8×10^-3g/l，cuso4·5h2o2.51×10^-3g/l)重悬细胞到od60030，底物d-木糖浓度分别是1号10g/l，2号20g/l，3号30g/l，4号40g/l。并加入10g/l碳酸钙和100mmolmops。在200rpm37℃条件下转化。最终底物20g/l产物最高，如图1。

实施例3：

将细胞收菌用生理盐水洗涤，用m9溶液重悬细胞到od600分别为10、20、30、40、60，底物d-木糖浓度20g/l，并加入10g/l碳酸钙和100mmolmops。在200rpm37℃条件下转化，如图2。

实施例4：

将细胞收菌用生理盐水洗涤，用m9溶液重悬细胞到od60030，底物d-木糖浓度20g/l，并加入10g/l碳酸钙和100mmolmops分别。加入表面活性剂tritonx-100，tween-20，tween-80,sds在200rpm37℃条件下转化，如图3。

液相检测方法：

每隔一定时间取样，液相检测丁三醇的积累情况，其中检测方法为色谱柱：bio-radaminexhpx-87h(300mm*7.8mm)，柱温：55℃，流动相：0.005mh2so4，流速：0.5ml/min，检测器：紫外，rid。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株利用d-木糖生产d-1,2,4-丁三醇的基因工程菌及其构建方法与应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1968

<212>dna

<213>大肠杆菌mg1655(escherichiacolimg1655)

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<213>大肠杆菌mg1655(escherichiacolimg1655)

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<213>恶臭假单胞杆菌(pseudomonasputida)

<400>3

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<213>新月柄杆菌(caulobactercrescentus)

<400>4

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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