一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的方法与流程

本发明涉及一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的方法，属于农业植保领域。

背景技术：

甘薯黑斑病(sweeppotatoblackrot)是甘薯栽培和贮藏中的主要病害之一，在世界各甘薯产区均有发生，其病原菌为甘薯长喙壳菌(ceratocystisfimbriataellisethalsted)，该菌分布广泛、种群分化复杂，主要为害幼苗茎基部及块根组织，引起死苗、烂床、烂窖，对甘薯生产影响极大。带有黑斑病菌的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物质，家畜食用后可引起中毒症状；用病薯作发酵原料会延缓发酵过程，降低酒精产量和质量，严重制约甘薯产业的发展。由于甘薯黑斑病可通过种薯、种苗及土壤等多种途径传播，很难彻底根除，选育抗黑斑病甘薯品种是防治该病害的重要途径之一。

目前生产上采用蘸孢子液针刺薯块接种法和孢子液侵染薯苗法进行黑斑病抗病品种选育，但这两种方法中所用的孢子悬浮液的制备需要25℃恒温培养5～7d，耗时较长，且薯片法制备的孢子悬浮液由于无法保证全程无菌操作，不可避免地会被杂菌污染，应用这种方法制备的孢子悬浮液进行甘薯黑斑病抗性鉴定有所欠缺。

此外，甘薯黑斑病的防治可以采取杀菌剂进行防控，筛选高效低毒的防治药剂也是甘薯黑斑病的重要研究方向之一。而筛选药剂的关键步骤之一就是通过利用药剂抑制孢子萌发和抑制菌丝生长来评价药剂对该病菌的毒力。采用传统的从黑斑病平板中洗涤孢子过滤的方法耗时长效率低，无法快速大量地为药剂筛选和抗药性风险评估等提供试验所需的分生孢子悬浮液。

因此，建立一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的技术体系，是本领域亟待解决的技术问题，也是甘薯黑斑病精准抗病鉴定、甘薯黑斑病药剂生物测定以及抗药性风险评估等研究的重要条件，而目前国内外尚未见甘薯黑斑病菌快速大量产孢的方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的方法，大大缩短孢子悬浮液制备时间，还可避免杂菌污染。

为了实现上述目的，本发明采用的一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的方法，包括以下步骤：采集黑斑病发病薯块，通过组织分离法分离黑斑病菌后将黑斑病菌接入ps液体培养基中，于31℃、120rpm/min摇培24h，纱布过滤去除菌丝，镜检测定孢子悬浮液浓度并用无菌水调节孢子悬浮液浓度至试验所需即可。

作为改进，所述的ps液体培养基，通过以下方法制得：将马铃薯洗净去皮，称取20g加入1l超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15g蔗糖，加超纯水定容至1l，每个三角瓶分装30ml，封口，然后于121℃高压灭菌15min备用。

作为改进，每30mlps液体培养基中接种10～12个菌碟。

作为改进，该方法具体包括以下步骤：

1)黑斑病菌的分离和纯化：从甘薯窖中采集黑斑病发病薯块，首先清洗薯块表面，然后用自来水流水冲洗约20分钟，将带病薯块取出擦干置于超净工作台中，取黑斑病病健交接部位置于75％酒精中进行表面消毒，再用0.1％的升汞消毒后，用灭菌水清洗干净后置于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)平板中培养，经分离纯化以及柯赫氏法则验证确定后保留菌株；

2)ps培养液的制备：称取马铃薯20g加入1l超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15g蔗糖，加超纯水定容至1l，每个三角瓶分装30ml，然后于121℃高压灭菌15min备用；

3)黑斑病菌培养：打取pda平板中的菌碟，每个三角瓶中接种10～12个菌碟，将接种好的三角瓶置于31℃恒温摇床中，于120rpm/min摇培24h；

4)孢子悬浮液制备：将摇培获得的悬浮液用纱布过滤去除菌丝后，镜检测定孢子液浓度，并采用无菌水将孢子悬浮液浓度调节到试验所需即可。

本发明的有益效果是：

1、该方法科学快速，过程简单、易于操作，仅需要培养皿、培养箱和超净工作台等常规仪器。

2、本发明采用ps液体培养液作为产孢培养基，以不同于常规黑斑病培养温度的较高温度31℃作为特定的摇培温度和120rpm/min转速来制备甘薯黑斑病菌孢子悬浮液，该方法比起传统的平板洗涤法和薯片法均极大地缩短了孢子悬浮液制备时间，显著地提高了产孢量，还避免了杂菌地污染，为黑斑病精准抗性鉴定和药剂生物测定等试验的顺利开展提供了有力的保障。

附图说明

图1为本发明采用ps培养液在特定培养条件下摇培1d制备黑斑病菌孢子悬浮液流程图；其中，a图为接种10个黑斑病菌菌碟至灭菌ps培养液；b图为31℃、120rpm/min摇培24h得到的混合液；c图为过滤后孢子悬浮液显微观察图；

图2为洗涤pda培养的黑斑平板制备孢子悬浮液流程图；其中，a图为接种黑斑病菌后25℃恒温培养5～7d得到的黑斑平板；b图为30ml无菌水洗涤平板后过滤菌丝；c图为过滤后孢子悬浮液显微观察图；

图3为洗涤薯片培养的黑斑病孢子制备孢子悬浮液流程图；其中，a图为切取好的待接黑斑病菌的干净薯片；b图为接种黑斑病菌25℃恒温培养5～7d的薯块；c图为洗涤过滤后孢子悬浮液显微观察图；

图4为本发明中不同培养时间的产孢图；其中，图a为打取10个菌碟接种到30ml灭菌ps培养基中震荡均匀后立即观察的孢子悬浮液显微观察图；图b为ps培养基培养1d的孢子悬浮液显微观察图；图c为ps培养基培养2d的孢子悬浮液显微观察图；图d为ps培养基培养4d的孢子悬浮液显微观察图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种甘薯黑斑病菌快速大量产孢的方法，具体包括以下步骤：

1)黑斑病菌的分离和纯化：从甘薯窖中采集黑斑病发病薯块，采用组织分离法分离黑斑病菌；首先清洗薯块表面，然后用自来水流水冲洗约20min，将带病薯块取出擦干置于超净工作台中，取黑斑病病健交接部位置于75％酒精中进行表面消毒，再用0.1％的升汞消毒后，用灭菌水清洗干净后置于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)平板中培养，经分离纯化以及柯赫氏法则验证确定后保留菌株；

2)黑斑病菌的培养和孢子悬浮液制备：

对照组一：采用pda平板接种活化后的黑斑病菌菌碟，将接种好的平板置于25℃恒温培养箱中培养至约5～7d，采用30ml无菌水洗涤平板表面孢子，纱布过滤去除菌丝后，测量孢子悬浮液中放大200倍显微镜下一个视野内孢子数，设置3个重复，每个重复制片3张；

对照组二：选择大小适中无病虫害侵染的薯块洗净自然晾干后，采用75％酒精表面消毒后晾干，切成厚约1cm的薯片，把切好的薯片放入配好的孢子悬浮液内浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入无菌培养皿内培养，期间采用纸巾或棉花团保湿纸，将接种的薯块置于25℃恒温培养箱中培养至约5～7d，薯片表面长满浅灰色的分生孢子，用30ml无菌水冲洗，纱布过滤去除菌丝后，测量孢子悬浮液中放大200倍显微镜下一个视野内孢子数，设置3个重复，每个重复制片3张；

实验组：采用马铃薯20g加入1l超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15g蔗糖，用超纯水将培养液补足至1l，每个三角瓶分装30ml，然后121℃高压灭菌15min备用；打取pda平板中的菌碟，每个三角瓶中接种10～12个菌碟(直径约6mm)，将接种好的三角瓶置于31℃恒温摇床中120rpm/min摇培，定期取出3瓶培养液，每瓶培养液制片3张，测量孢子悬浮液中放大200倍显微镜下一个视野的孢子数，不同培养条件下的产孢数如表1所示，实验组不同培养时间得到的孢子液镜检如图4所示。

其中，对照组一采用pda平板法培养后洗涤制备孢子悬浮液(如图2所示)；对照组二采用传统接种薯片培养法制备孢子悬浮液(如图3所示)；实验组采用本发明的方法采用ps液体培养基摇培产生黑斑病菌孢子并制备孢子悬浮液(如图1所示)。

表1不同培养条件下的产孢数

注：不同大写字母表示经duncan氏新复极差法检验在p＜0.05水平差异显著；不同小写字母表示经duncan氏新复极差法检验在p＜0.01水平差异显著。

如表1所示，该结果表明：使用本发明方法的ps液体培养基在特定培养条件31℃、120rpm/min条件下摇培1d，在放大200倍显微镜下平均每个视野可观察到211个孢子，与采用对照一和对照二25℃培养5～7d制备的孢子悬浮液制备方法下平均每个视野可观察到的孢子数93和95呈极显著水平的差异；

同时，对比采用本发明方法的ps液体培养基摇培0d，1d，2d和4d所制备的孢子悬浮液，发现摇培2d和4d后获得的孢子悬浮液在同样放大倍数的显微镜下平均每个视野观察到的孢子数分别为136和137，显著性分析表明ps液体培养基摇培2d和4d比摇培1d所得到的孢子悬浮液中平均每个视野的孢子数211显著降低，且从图4可以看出，显微观察到的培养4d的黑斑病菌孢子已有部分开始消解，因此，本发明采用的ps液体培养基在特定培养条件31℃、120rpm/min下摇培1d即可获得大量高浓度孢子悬浮液，极大地缩短了黑斑病菌产孢时间，显著地提高了产孢量；

同时，由于培养期间全程无菌操作，条件简易可控，因此病原菌不易被污染，可以有效避免薯片法产孢培养的薯片腐烂、杂菌多、时间长等引起孢子液不纯，使甘薯黑斑病抗性鉴定和甘薯黑斑病药剂生物测定试验更为精准高效。

该黑斑病菌产孢方法科学高效，操作简单，可极大地缩短传统黑斑病菌孢子悬浮液制备的时间，且避免了传统孢子悬浮液制备方法中杂菌的污染，为甘薯黑斑病精准抗性鉴定、黑斑病菌的室内药剂筛选、抗药性风险评估以及其他需要借助分生孢子悬浮液来完成的试验顺利开展提供了有力的保障。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。