本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一株坚强芽孢杆菌及其用途。
背景技术：
无花果，为桑科无花果属落叶灌木或乔木，引进栽培近千年。果实可溶性固形物含量达24％，甘甜味美，含有18种氨基酸，其中8种是人体必需氨基酸。无花果具有极高的药用价值，能净化肠道，促进有益菌类增殖，它的抗癌功效也得到世界各国公认，被誉为“21世纪人类健康的守护神”。
石榴，为石榴科石榴属落叶果树，灌木或小乔木，引进栽培近两千年。石榴具有丰富的营养价值和保健功能，含抗氧化剂最高，其抗氧化能力是柠檬的11倍。石榴汁富含可溶性多酚化合物，具有抗动脉粥硬化的性质。同时石榴还是重要的观赏树种。
无花果、石榴已成为新兴的经济林产业。但由于气候的变化和栽培方式的改变、栽培面积的迅速扩大，无花果、石榴等小浆果病虫害已呈现多发、频发、重发的态势，尤其是炭疽病已经严重威胁到产业健康发展。目前，防治措施以依赖化学农药为主，导致病原菌抗药性逐年增加，防治效果下降，农药残留超标等问题，严重影响果品质量安全和生态环境安全。
生物防治是植物病虫害防治的必然趋势，因此利用拮抗微生物防治无花果、石榴炭疽病有望成为代替化学药剂的一种安全、无毒及有效的新方法。拮抗微生物不仅可以防病，而且还能促进植物生长，对改善林地生态系统，保持林间生物多样性，以及维护林田生态平衡实现林业可持续发展将起到重要作用。为了顺利完成制定的《到2020年农药使用量零增长行动方案》，农业部正大力推广利用生物药剂。与其他生物农药相比，微生物源生物农药生防因子繁殖速度快、防治效果持久、开发利用途径多、不易产生抗性、发酵工艺简单及生产成本低，成为生物农药领域的研究热点，依然是未来较长一段时间生物农药登记的主要选择。尤其是利用拮抗微生物防治无花果、石榴炭疽病还未见报道。
本发明申请人于2009年公开了一株坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)Bf-02CGMCC No.3129(专利号：ZL200910256465.2)，该菌株的杀菌谱广，主要用来防治核桃炭疽病、黄瓜灰霉病、小麦纹枯病、苹果轮纹病、烟草赤星病、玉米小斑病、冬枣黑斑病、棉花枯萎病、棉花红腐病、小麦赤霉病等多种植物病害，其中防治黄瓜灰霉病、核桃炭疽病效果显著。但是室内对峙试验表明：它对无花果、石榴炭疽病的抑菌率分别为60.30％和61.12％，防治效果较差。因此寻找一种高效防治无花果、石榴炭疽病的拮抗微生物是当前需要解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株能高效防治无花果、石榴炭疽病的坚强芽孢杆菌菌株Bf-01，该菌株具有生长速度快、产孢量大，在无花果、石榴根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明提供的坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)菌株Bf-01，是从山东省林业科学研究院试验苗圃无花果根际土壤中，采用稀释分离法分离获得的，已于2009年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3039。其具有以下微生物学特性：Bf-01菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，好氧生长。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。
本发明的坚强芽孢杆菌菌株Bf-01的培养方法或繁殖方法：普通培养采用NA培养基保存。实验室液体培养采用略加修改的NB液体培养基。NB配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。大量发酵培养配方(重量比)：黄豆粉2.5％，玉米粉3％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3。培养条件：培养温度28℃，初始pH7.3，装液量75％，接菌量3.0％，培养时间36h，通风1：0.8。采用此培养基发酵培养，菌数≥100亿/g。
本发明的另一个目的是提供一种含有该菌株的微生物菌剂，其制备方法包括以下步骤：
(1)将保存的坚强芽孢杆菌菌株Bf-01转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养48-72h；
(2)在无菌条件下，将培养好的坚强芽孢杆菌菌株Bf-01用无菌水按体积比1：10稀释后，吸取1mL，置于装有NB液体培养基的摇瓶中，28℃摇床振荡培养18-20h得到种子液；
(3)按体积比3.0％将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间24h，通风1：0.8。发酵完成后，菌数≥100亿/g。
上述微生物菌剂优选为水分散粒剂，所述水分散粒剂通过包括以下步骤的方法制得：
(4)将坚强芽孢杆菌发酵液加入基质进行混匀，然后进行干燥，得到原粉；所述基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种；所述基质与发酵液的质量比为0.5～1.5：1，优选1：1；
(5)按重量份，干燥好的坚强芽孢杆菌原粉1-30、轻质碳酸钙1-60、葡萄糖0.5-60、羧甲基纤维素0.02-10、湿润剂1004 0.5-30、动物蛋白0.2-30，将上述原料混合均匀，使混合料的坚强芽孢杆菌Bf-01含量为0.1-100亿活菌/g；
(6)控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机中粉碎到150筛目以上，然后进行沸腾造粒或挤压造粒，水分控制在6-8％，pH控制在7-7.5。
该微生物菌剂可以用作生物农药，用于防治无花果、石榴炭疽病。因此，又一方面，本发明提供了坚强芽孢杆菌菌株Bf-01或者本发明的微生物菌剂用于防治无花果、石榴炭疽病中的用途，以及在提高无花果和石榴鲜果重方面的用途。
本发明还提供一种用于防治无花果、石榴炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的无花果、石榴施用坚强芽孢杆菌菌株Bf-01或者上述微生物菌剂。
实验表明，本发明的坚强芽孢杆菌株Bf-01具有菌株新颖、高效、生长速度快、产孢量大，在无花果、石榴叶片、果实表面能够快速大量定殖的特点，其10亿/g水分散粒剂300倍防治无花果、石榴炭疽病效果显著，防治效果达到78.83％、80.10％，且无花果、石榴生长健壮，无药害产生，鲜果增重达10％以上。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治无花果、石榴炭疽病中具有重要应用前景。
附图说明
图1为以16SrDNA序列为基础的Bf-01菌系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1菌株的分离与鉴定
1.分离：
本发明的坚强芽孢杆菌是从山东省林业科学研究院试验苗圃无花果根际土壤中采用土壤稀释分离法分离获得的，分离方法为：
(1)土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，实验室阴干，混合过粗筛，取25g作分离用；
(2)培养基平板制备：将NA培养基(营养琼脂培养基)和PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；
(3)称取1g土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10-2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10-7；
(4)取上述土壤悬浮液0.5mL，加到培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱28℃恒温培养5-7d。
(5)将单个菌落在NA培养基上划线，得到单菌落，转移至NA试管斜面培养基中，至28℃恒温培养。
(6)以无花果炭疽病菌为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到一株对无花果炭疽病菌具有较强抑制活性的菌株，编号Bf-01。
所述NA培养基配方为蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.3；所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)200g，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。
2.菌株鉴定
(1)微生物学特性：Bf-01菌体杆状，革兰氏阳性菌，周生鞭毛，好氧生长。NA培养基培养菌落圆形，白色，平展，表面粗糙，中间有圆环形突起，边缘整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。其它特性见下表1：
表1 Bf-01菌株的生理生化特性
注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性。
(2)分子生物学特性：
16S rRNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
将Bf-01菌株的16S rRNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与B.firmus(DQ355388)同源性为99.51％，结合Bf-01菌株的形态特征、生理生化特性，确定Bf-01属于坚强芽孢杆菌B.firmus。
此菌株已于2009年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3039。
实施例2坚强芽孢杆菌菌株Bf-01对无花果、石榴炭疽病室内效果验证
1.实验方法
采用平板对峙培养法，将供试的无花果、石榴炭疽病菌菌饼(9mm)移至平板中央，四周2cm处接种Bf-01菌株，置27℃生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。
2.结果
由表2可以看出，Bf-01菌株对无花果、石榴炭疽病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，处理后菌落直径分别为10.3mm、11.6mm，对照菌落直径分别为70.6mm、72.9mm，菌丝生长抑制率分别为85.41％、84.09％。
表2.Bf-01对无花果、石榴炭疽病菌室内抑菌活性测定
实施例3坚强芽孢杆菌菌株Bf-01水分散粒剂的制备
NB液体培养基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。
大量发酵培养配方(重量比)：黄豆粉2.5％，玉米粉3％，轻质碳酸钙0.2％，氯化钠0.1％，其余为水，pH 7.3。
(1)将保存的坚强芽孢杆菌Bf-01转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养48-72h；
(2)在无菌条件下，将培养好的坚强芽孢杆菌Bf-01按体积比1：10用无菌水稀释，吸取1mL，至于装有NB液体培养基(100mL)的250mL三角瓶中，28℃摇床振荡培养18-20h得到种子液；
(3)按体积比3.0％将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间24h，通风1：0.8。发酵完成后，菌数≥100亿/g。
(4)将坚强芽孢杆菌发酵液加入等质量的草炭进行混合均匀，干燥；
(5)按重量份，干燥好的坚强芽孢杆菌原粉20、轻质碳酸钙13、葡萄糖50、羧甲基纤维素1、湿润剂1004 6、动物蛋白10；将上述原料混合均匀，控制加工温度20-30℃，在气流粉碎机中，粉碎到200目，进行挤压造粒，水分控制在6-8％(质量百分含量)，pH控制在7-7.5。所得到的水分散粒剂的坚强芽孢杆菌菌株Bf-01含量为10亿活菌/g。
实施例4防效验证
本实施例提供了坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂针对无花果、石榴炭疽病的相关实验。
1.1供试药剂
本发明实施例3制备的坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂；75％代森锰锌水分散粒剂(市售)。
1.2供试作物与防治对象：
供试作物为无花果，品种为绿早；防治对象：炭疽病；
供试作物为石榴，品种为大青皮甜；防治对象：炭疽病。
1.3试验地情况
于2013年分别在山东省嘉祥县无花果种植园、枣庄市峄城区石榴种植园中，进行林间防治无花果、石榴炭疽病试验。树势中等偏弱，病害发生严重。所有试验小区栽培条件及管理措施一致，开花后3周用药1次，6月10日起，每隔15d施药1次，连用3次，共计4次。
1.4试验设计及安排
本试验设计了10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂300倍、500倍、700倍，75％代森锰锌水分散粒剂400倍液及不施药清水作对照共5个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区10棵无花果树、石榴树。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1药效调查、调查时间和次数
采收前10d调查，无花果每个处理随机调查300个果实，石榴每个处理随机调查50个果实，计算病情指数、防治效果，整个试验调查1次。
1.5.2安全性调查
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察无花果、石榴的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
分级方法(以果实为单位)：
1.5.3病情指数分级标准
0级：无病班；
1级：病班面积占整个果实面积的5％以下；
3级：病班面积占整个果实面积的6％-10％；
5级：病班面积占整个果实面积的11％-25％；
7级：病班面积占整个果实面积的26％-50％；
9级：病班面积占整个果实面积的51％以上。
1.5.4药效计算方法
药效按式(1)、(2)计算：
式中：CK0——空白对照区施药前病情指数；
CK1——空白对照区施药后病情指数；
PT0————药剂处理后施药前病情指数；
PT1————药剂处理后施药后病情指数；
1.6对作物的直接影响
观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对作物的其他有益影响(例如促进成熟、刺激生长等)。
用下列方式记录药害：
(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。
(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
(1)按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。
药害分级方法：
—：无药害；
+：轻度药害，不影响作物生长；
++：中度药害，可复原，不会造成作物减产；
+++：中度药害，影响作物正常生长，对作产量和质量造成一定程度的损失；
++++：严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。
(2)将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。
同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)
2.结果
2.1供试药剂对无花果、石榴炭疽病的防治效果
表3结果显示，10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂对无花果炭疽病具有较好的防治效果，其中10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂300倍、500倍防治效果最好，防治效果分别达78.83％、77.97％，在P<0.05水平上无显著性差异，明显高于700倍和75％代森锰锌的防治效果。
表3坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂防治无花果炭疽病田间药效试验
注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。
表4坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂防治石榴炭疽病田间药效试验
注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。
表4结果显示，10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂对石榴炭疽病具有较好的防治效果，其中10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂300倍、500倍处理后，防治效果最好，病情指数6.01％和6.16％，防治效果分别达80.10％、79.60％，在P<0.05水平上无显著性差异，明显高于700倍和75％代森锰锌的防治效果。
2.2安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，无花果、石榴生长正常，无药害产生，说明10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂在供试浓度对无花果、石榴安全。
2.3坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂对无花果、石榴增产效果
表5坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂对无花果鲜果重试验结果
表5结果显示，10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂不同浓度处理后，无花果鲜果重分别为99.8g、97.9g、94.1g，清水对照鲜果重为88.6g，不同处理均有增产效果，其中300倍处理后，增产率达12.64％，效果明显。
表6坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂对石榴鲜果重试验结果
表6结果显示，10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01水分散粒剂不同浓度处理后，与清水对照相比，石榴鲜果重分别增加78.2g、57g、38.3g，其中300倍处理后，增产率达15.54％，效果明显。
3.小结
从无花果病果率和防治效果来看，10亿/g坚强芽孢杆菌Bf-01对无花果、石榴炭疽病具有较好的防治效果，稀释300倍后防治效果可达78.83％、80.10％，明显好于对照药剂，差异显著。
从对无花果、石榴安全性调查来看，坚强芽孢杆菌Bf-01对无花果、石榴具有明显的防病促生效果，鲜果增重率达10％以上，安全可靠。