莫海威芽胞杆菌的应用及其降解萘的方法与流程

本发明涉及莫海威芽胞杆菌的应用及其降解萘的方法，属于环境微生物应用领域。
背景技术：
：萘(naphthalene,NAP)是环境中普遍存在的具有代表性的一类重要持久性有机污染物(persistentorganicpollutants，POPs)。大量研究已经证明，萘具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，是环境中一类危险而且需重点研究的、也是各国优先控制的污染物。由于大气沉降、污水灌溉、固体废弃物填埋渗漏、油田开采和石油产品大量使用等，造成全球范围内地方土壤萘污染，在我国许多地方已出现较严重污染的情况。萘由于性质稳定、难于降解，在土壤环境中呈不断积累的趋势，严重危害着土壤的生产和生态功能、农产品质量和人类健康。目前，治理污染土壤的方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。其中生物修复技术因具有成本低、无二次污染、可大面积应用等独特优点而越来越受到人们的重视，是目前最具潜力的土壤修复技术之一。莫海威芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）主要应用在脂肪酶的发酵，目前未见有关利用莫海威芽孢杆菌降解萘的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能够降解萘的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株降解萘的方法。技术方案本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；是杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；经鉴定，该菌株是一种莫海威芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）；命名为莫海威芽孢杆菌B1811；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏编号为CGMCCNo.12805；保藏时间为2016年7月21日。本发明的莫海威芽孢杆菌B1811能够降解萘（NAP）；莫海威芽孢杆菌B1811对NAP的降解率可高达96.4-99.6%。采用本发明的莫海威芽孢杆菌B1811降解NAP的其中一种方法为：在酵母提取物存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与NAP接触。其中，酵母提取物的量会影响降解率。所以，上述方法，优选的，在改良BSM基础盐液体培养基存在的条件下，莫海威芽孢杆菌B1811与NAP接触；所述改良BSM基础盐液体培养基，每1L中含有以下成分：酵母提取物3-8g，硫酸铵0.5g，氯化钠4.0g，三水合磷酸钾0.5g，七水合硫酸镁0.4g，蒸馏水余量；pH7.0。具体的，是将NAP加入改良BSM基础盐液体培养基；将莫海威芽孢杆菌B1811种子液接种于改良BSM基础盐液体培养基，在150-200rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。上述方法，优选的，改良BSM基础盐液体培养基中酵母提取物的含量为6g/L。上述方法，优选的，培养条件为转速175rpm，温度30℃，其他条件相同情况下，此条件下菌B1811的降解率最高。上述方法，莫海威芽孢杆菌B1811种子液相对于改良BSM基础盐液体培养基的接种量的变化，对单位时间内的NAP降解率有明显影响；通常情况下，接种量越多，单位时间内降解率越高；但是对最终降解率（发酵液中NAP含量达到稳定时的降解率）没有明显影响。上述方法，所述莫海威芽孢杆菌B1811种子液是由莫海威芽孢杆菌B1811培养获得的。在获得莫海威芽孢杆菌B1811的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得莫海威芽孢杆菌B1811种子液。本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。本发明所用专业术语说明：rpm是转速单位，1rpm是指每分钟旋转一转。有益效果：（1）首次分离培养出能够降解萘的莫海威芽孢杆菌B1811；（2）莫海威芽孢杆菌B1811对萘的降解率最高为99.6%；（3）本发明降解萘的方法，与本发明之前细菌、真菌降解萘的方法相比，在菌种来源上具有新意，其对萘的降解效果显著，降解周期短，操作简单。保藏说明：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所保藏日期：2016年7月21日保藏编号：CGMCCNo.12805分类命名：莫海威芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）。附图说明图1为本发明中所述莫海威芽孢杆菌B1811的显微镜下形态特征；图1中，莫海威芽孢杆菌B1811为杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢；图2为采用紫外分光光光度法获得的吸光值（OD）-萘浓度的标准曲线；图3为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的16SrDNA序列系统发育分析；图4为莫海威芽孢杆菌B1811与相关种的recA序列系统发育分析。具体实施方式下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1菌株B1811的鉴定菌株B1811分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16srDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,简称NCBI)数据库进行菌株比对。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，如SEQIDNO.2所示；扩增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全长为1461bp。将该扩增所得16SrDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株BacillusmojavensisRO-H-1T/JH600280同源性达99.8％。(2)gyrB基因序列分析gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQIDNO.4所示；gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQIDNO.5所示；扩增所得gyrB基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全长为887bp。将该扩增所得gyrB基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1811”与模式菌株B.malacitensisCECT5687(DQ903179)同源性达99.5％。因此可以判定B1811为一种全新的莫海威芽孢杆菌。经过鉴定确认其所属菌种后，莫海威芽孢杆菌B1811于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12805；此生物材料已经存活试验测试并通过该试验。实施例2莫海威芽孢杆菌B1811液体摇瓶培养液制备（1）斜面培养：莫海威芽孢杆菌B1811接种于斜面培养基上，在40℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖2.0g、蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、琼脂1.8g、蒸馏水余量，pH为中性，115℃灭菌20min。（2）取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在175rpm、30℃的条件下恒温震荡培养24h，得到种子培养液；所述种子培养基，每1L中含有的成分为：硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、琼脂粉15g、酵母提取物5g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌25min。（3）将5.0mg的NAP以无菌操作加入含有50mL的改良BSM基础盐液体培养基的摇瓶中，将莫海威芽孢杆菌B1811的种子培养液以1mL的接种量接种到摇瓶中，在175r/min、30℃的条件下恒温震荡培养72h；所述改良BSM基础盐液体培养基，每1L中含有的成分为：酵母提取物5.0g、硫酸铵0.5g、氯化钠4.0g、三水合磷酸钾0.5g、七水合硫酸镁0.4g、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌15min。实施例3NAP标准曲线制定与含量测定（1）以正己烷为溶剂配制400mg/L的萘母液，分别稀释20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、80倍、100倍、200倍以备用，取2.5mL不同稀释倍数的萘溶液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度计分别测定275nm波长下的吸光值，并以吸光值为纵坐标，萘的浓度作为横坐标绘制标准曲线；标准曲线如图2所示；进而获得吸光值-浓度方程：y=0.0424x-0.0033，x为萘的浓度，y为吸光值。（2）取2.5mL实施例1获得的发酵液置于3mL石英比色皿中，用紫外分光光度计分别测定275nm波长下的吸光值；然后根据吸光值-浓度方程计算出萘的浓度。（3）降解率的计算公式：降解率%=(C0-C)/C0*100%，C0为用莫海威芽孢杆菌B1811降解之前的NAP质量浓度（mg/L）（即实施例1步骤（3）发酵培养之前摇瓶中混合液的NAP质量浓度89.29mg/L）中，C为发酵液中的NAP残留浓度（mg/L）。经计算，实施例1的降解率为98.1%。实施例4莫海威芽孢杆菌B1811降解萘条件（接种量）的优化将实施例2步骤（3）中的种子液接种量依次改为2、3、4、5、6mL，其他操作同实施例1。按照实施例3的步骤测定发酵液的NAP浓度，进而计算NAP的降解率。在不同接种量条件下，NAP降解率如表1所示。实施例5莫海威芽孢杆菌B1811降解萘条件（改良BSM基础盐液体培养基的酵母提取物的含量）的优化将实施例2步骤（3）中所用改良BSM基础盐液体培养基的酵母提取物的含量依次修改为3、4、5、6、7、8g/L；其他操作同实施例2。按照实施例3的步骤测定发酵液的NAP浓度，进而计算NAP的降解率。在不同酵母提取物的含量条件下，NAP降解率如表2所示。表1种子液接种量（mL）NAP降解率（%）00198.1298.3398.9499.2599.5699.5；表2酵母提取物的含量（g/L）NAP降解率（%）00396.4496.7598.1699.6799.2899.2<110>北京工商大学<120>莫海维芽胞杆菌的应用及其降解萘的方法<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20<210>2<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>2AAGGAGGTGATCCAGCC17<210>3<211>1461<212>DNA<213>人工合成<400>3ATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG60AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA120CCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC180AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGC240GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC300GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT360GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCG420AATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG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