一株高效除磷和降解卵磷脂的假单胞菌的制作方法

本发明属于环境微生物学领域，具体涉及一株高效除磷和降解卵磷脂的假单胞菌及其在废水处理、农业等方面的应用。

背景技术：

近几十年来，随着我国人口剧增、工业化的大力发展，水体富营养化污染问题愈发严重。一般认为，磷是水体富营养化的主要诱发因子，废水除磷是防止水体富营养化的重要途径；另一方面，磷是植物生长所需的主要营养元素，磷素不足会严重影响植物的生长。为了实现磷资源的可持续发展，目前在废水除磷领域，如何变传统的“处理”为“回收”，已经逐渐成为世界各国学者的研究热点和政府的重点关注对象。

假单胞菌属在自然界分布广泛，是土壤中存在的最常见的一种革兰氏阴性菌，其中一些具备抑菌、硝化和反硝化等功能，对生物防治和环境治理有重大意义。目前有关假单胞菌的报道主要集中在生物防治和废水处理等方面。如专利201510400702.3（中国，刘立鹤等）报道了一株铜绿假单胞菌，能有效防治玉米大斑病、玉米茎基腐病、玉米纹枯病、包菜叶腐病、豇豆锈病、辣椒叶腐病等植物病害；专利201410598044.9（中国，李强等）发现了一株能处理污水中氨氮的短程硝化细菌，经鉴定为假单胞菌，其对污水中的总氮和COD有一定的去除能力；专利200910032681.9（中国，辉刘等）公开了一株能够解卵磷脂、促进杨树苗生长的蜡状芽孢杆菌；在专利201410665101.0（中国，朱希坤等）中提到一株可以降解不同的酚类化合物的假单胞菌，在处理含酚的工业废水中有很好的应用价值；专利201010538869.3（中国，袁红莉等）则报道了一株施氏假单胞菌及其在水体除磷中的应用等。目前，尚无既能处理磷污水又有降解卵磷脂功能的假单胞菌报道，且已公开的磷污水处理方法也不能实现对磷的回收再利用。

本发明菌株MET69是一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)，兼具除磷和降解卵磷脂的功能。该菌株与现有报道相比，在除磷能力上有显著优势，且该菌株制成固定化小球后，不仅除磷效果进一步提升，并且还能够实现对磷的回收和循环利用。此外，土壤中的磷有20%～50%是以植酸、核蛋白和卵磷脂的状态存在的，难以被植物吸收利用，菌株MET69对卵磷脂有降解作用，将其施用于土壤中能够显著提高土壤对植物的供磷能力，在制备生物菌肥和解磷酶制剂中都有一定的应用前景。因此，本发明菌株MET69对磷废水处理和生物农业的发展均具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株高效除磷和降解卵磷脂的假单胞菌(Pseudomonas sp.)MET69，并将其固定化小球应用于废水除磷。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一株高效除磷和降解卵磷脂的假单胞菌，分类命名为：假单胞菌(Pseudomonas sp.)MET69，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2016474, 保藏日期：2016年9月12日。

菌株MET69的16S rDNA序列，见序列表。

上述假单胞菌MET69的培养方法：牛肉膏蛋白胨培养基（蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl5 g/L，蒸馏水1000ml，pH 7.0~7.2），装液量100 mL（250 mL锥形瓶），种子液接种量1%（牛肉膏蛋白胨培养基体积的1%），以150 r/min在28℃培养10 h。

上述假单胞菌MET69的高效除磷研究：含磷废水（PAM培养基）配方（g/L）：柠檬酸钠4.0，氯化钠0.5，硫酸铵2.5，氯化钙0.25，硫酸镁0.25，磷酸二氢钾0.0439，麦芽糖0.01，甲苯胺蓝-O 0.025，蒸馏水1000ml，pH7.2，121℃灭菌30min。

上述假单胞菌MET69的固定化小球处理高磷浓度废水的研究：模拟废水配方（g/L）：葡萄糖0.3，蛋白胨0.1，醋酸钠0.15，氯化钠0.05，，七水合硫酸镁0.15，氯化铵0.18，磷酸二氢钾（以P计：20:mg/L，0.0878），蒸馏水1000mL，pH7.0，115℃灭菌25min。

上述假单胞菌MET69对卵磷脂降解的研究：基础培养基：葡萄糖10.0 g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，NaCl0.3g，KCl0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·4H₂O 0.03 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL ，pH自然，115℃灭菌25min。灭菌后冷却至 50～60℃。将一个生鸡蛋表面消毒后取蛋黄倒入灭菌三角瓶内，加入 50ml 无菌水，混匀按添加量10%加入基础培养基中，得卵磷脂培养基。

与现有的专利菌株比较，本发明菌株具有以下优点：

（1）用本发明菌株MET69处理低浓度废水（P≤10mg/L）时，24h内可使废水满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级B标准（P<0.5mg/L）；用本发明菌株MET69与壳聚糖交联的固定化小球处理高磷浓度废水（P约20 mg/L）时，48h磷去除率可达98.54%，处理后可满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级B标准（P<0.5mg/L），说明菌株MET69的除磷容量总体较好，且环境适应性好，在工业化上应用价值大。

（2）本发明菌株MET69对卵磷脂具有较好的降解能力，能够在以卵磷脂为唯一磷源的培养基上形成显著的解磷圈，将MET69菌剂施于土壤中，能够显著提高土壤的速效磷含量，是良好的土壤改良剂。

附图说明

图1是MET69菌株的多除磷酸盐染色效果。

图2是MET69在牛肉膏蛋白胨液体培养基中的生长曲线。

图3是MET69菌株在牛肉膏蛋白胨平板上的培养形态。

图4是MET69菌株的16S rDNA基因序列系统发育树。

图5是MET69壳聚糖固定化小球处理高磷浓度废水效果。

图6是MET69对卵磷脂的降解效果。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施案例中涉及到的培养基组分：

PAM-TBO培养基(g/L)：柠檬酸钠4.0，氯化钠0.5，硫酸铵2.5，氯化钙0.25，硫酸镁0.25，磷酸二氢钾0.0439，麦芽糖0.01，甲苯胺蓝-O 0.025，蒸馏水1000ml，pH7.2，PAM-TBO培养基用于除磷菌的定性筛选。

富磷培养基(g/L)：醋酸钠5，氯化铵2, 磷酸二氢钾0.0439，七水合硫酸镁0.5，氯化钙0.2，蒸馏水1000ml，pH7.0~7.2，富集培养基用于除磷菌的活化。

牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，蒸馏水1000ml，pH7.0~7.2，牛肉膏蛋白胨培养基用于菌株的分离纯化、保藏及驯化。

模拟废水配方（g/L）：葡萄糖0.3，蛋白胨0.1，醋酸钠0.15，氯化钠0.05，，七水合硫酸镁0.15，氯化铵0.18，磷酸二氢钾（以P计：10mg/L，0.0439；以P计：20:mg/L， 0.0878），蒸馏水1000mL， pH7.0。

卵磷脂培养基：基础培养基（g/L）：葡萄糖10.0 ，(NH₄)₂SO₄ 0.5 ，MgSO₄·7H₂O 0.3，NaCl 0.3，KCl 0.3 ，FeSO₄·7H₂O 0.03 ，MnSO₄·4H₂O 0.03 ，琼脂20，蒸馏水1000 mL ，pH自然，115℃灭菌25min。基础培养基灭菌后冷却至 50～60℃。将一个生鸡蛋表面消毒后取蛋黄倒入灭菌三角瓶内，加入 50ml 无菌水，混匀按添加量10%加入基础培养基中，即得卵磷脂培养基。

实施例1假单胞菌(Pseudomonas sp.)MET69的筛选

VasviChaudhry和Chandra ShekharNautiyal曾在2011年第102卷17期的《Bioresource Technology》上报道了一种高通量筛选除磷菌的方法，利用甲苯胺蓝能够对菌株中的多除磷酸盐颗粒染色的特性，可以快速鉴定除磷菌。本发明菌株即通过此方法筛选获得，具体操作步骤：

①将采集到的湖北省黄石市阳新县化工厂废水样与无菌水按1:9的比例稀释混匀，所得悬浮液浓度为10^-1；

②再将此菌悬液10倍比稀释成不同浓度，分别涂布于富磷培养基上，28℃倒置培养48h；

③挑取形态特征不同的菌落进行划线纯化，对纯化菌株进行编号，留存备用；

④将上述菌株活化获得种子液，在96孔板上每孔分别加0.18ml液体PAM-TBO培养基，并接种20μL菌液，纵列每三个孔为一组，即每个菌株做3次重复，以不接种菌样的处理作为对照；

⑤用封口膜将96孔板密封，正置28℃培养2~3d，观察孔板内褪色情况，结果见图1。褪色越明显表明菌株除磷能力越强，对褪色明显的菌株进行甘油法保藏。

通过上述筛选方法，获得1株能够使甲苯胺蓝培养基显著褪色的菌株，编号为MET69，即本专利菌株。MET69活化后按1%接种量（占牛肉膏蛋白胨培养基体积的1%）接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，生长曲线见图2。由图可知MET69的对数期大约在10~28h，此时MET69活性最强，除磷效率较高。

实施例2 菌株MET69的鉴定

（1）形态特征和生理生化特征

菌株MET69的形态和生理生化特征：在牛肉膏蛋白胨平板上28℃恒温培养48h，菌落呈2~3mm圆形，边缘光滑，呈淡黄色，不透明，具体菌落形态见图3。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，得该菌株还有如下特征：革兰氏染色阴性，菌体杆状，无芽孢和荚膜形成，兼性厌氧，无鞭毛，过氧化氢酶阳性，淀粉酶反应阴性，甲基红阴性，V-P反应阴性。

（2）16S rDNA分子鉴定

以菌株DNA 为模板进行16S rDNA V3 区的PCR 扩增，引物序列为：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；

PCR体系建立（50μL）：Template DNA 1μL、Forward Primer(10uM) 1μL、Reverse Primer(10uM) 1μL、Taq-Plus 1μL、Taq-Plus Buffer 5μL、dNTPs(2mM）5μL、无菌水36μL。

PCR反应参数为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸90s，共30个循环，最后再72℃延伸10min。

PCR结束后，取5μLPCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小约1.5kb。将PCR产物回收后送至武汉擎科创新生物科技有限公司进行测序。所测序列长度为1566bp。

将所测得序列在NCBI上进行BLAST 比对，结果显示序列与菌株MET69相似性达99%的均为假单胞菌属。下载相关性较高的16S rDNA序列，用MEGA软件构建MET69的系统发育树，见图4。

结合菌株形态、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析，最终确定菌株MET69是一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)。

实施例3本发明菌株除磷性能研究

为了评价本发明菌株的除磷性能，对菌株MET69在磷浓度分别为5、10、15、20 mg/L的含磷废水（PAM培养基）中的除磷率进行测定并比较。

将菌株MET69活化培养至OD₆₀₀为1.0，按10%的接种量（为PAM培养基的体积10%）转接至200 mL的PAM培养基（以P计：5、10、15、20 mg/L）中，于28 ℃、150 r/min条件下培养，隔12、24、36、48、60（h）取样，10000 r/min离心10 min后，钼锑抗比色法测定上清液的磷浓度（GB 11893-89），并计算除磷率（结果见表1）。

除磷率（%）=（X_进样－X_出样）／X_进样×100％

X_进样：接入菌株前的富集培养液的总磷浓度

X_出样：接入菌株后的富集培养液的总磷浓度

表1 MET69处理不同磷浓度废水效果比较

结果表明，本发明菌株能高效处理低浓度（P≤10mg/L）含磷废水，处理后24h内可满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级B标准（P<0.5mg/L），除磷效果显著，但在处理较高浓度（10<P≤20mg/L）的含磷废水时，尚不能满足排放标准。为了提高菌株MET69的除磷性能和循环性能，对菌株进行固定化处理研究。

实施例4菌株MET69固定化小球高磷浓度废水（P约20 mg/L）处理

固定化空白小球的制备：将2.5%壳聚糖胶体溶液用8号针头滴入凝结液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得到中空壳聚糖球，取出用去离子水洗涤，备用。

固定化包埋菌小球的制备：将制备好的固定化空白小球放入湿菌与灭菌生理盐水的质量体积比（g:ml）为2:100的菌悬液中，吸附2 h，取出壳聚糖球并用灭菌生理盐水洗涤后备用。

分别称取2g固定化空白小球、固定化包埋菌小球，然后分别放入装有200 ml磷浓度为20 mg/L废水的500 ml锥形瓶中，在28 ℃、150 r/min摇床中处理，每隔一定时间0、12、24、36、48、72（h）取废水5 ml，于离心机中10000 r/min离心10 min，取上清，按照钼酸铵分光光度法（GB11893-89）测定其中总磷含量，计算除磷率。

实验结果见附图5，如图所示，固定化包埋菌小球处理高磷浓度废水在48 h时，除磷效果达到最佳，除磷率为98.54%，此时体系中的磷浓度为0.292 mg/L。

实验结果表明，用假单胞菌MET69与壳聚糖的交联小球处理高磷浓度废水（P约20 mg/L），，能够在48 h内使其满足《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级B标准（P<0.5mg/L）。说明菌株MET69被固定化后，不仅除磷能力进一步提高，还实现了对磷素的回收和循环利用。

实施例5菌株MET69对卵磷脂的降解作用

MET69对卵磷脂的降解作用采用解磷圈法进行验证，将MET69在牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化10h后，在卵磷脂平板上划线（点样），37℃下倒置培养48h后，可见MET69的菌落周围出现明显的解磷圈（解磷圈是指在含有机磷的固体培养基上，菌落周围产生的因有机磷降解而形成的透明圈），结果见附图6。MET69能够在以卵磷脂为唯一磷源的平板上生长并形成透明解磷圈，说明MET69对卵磷脂有较好的降解作用。

实施例6 MET69对土壤速效磷含量的影响

取大学周边未施肥的普通土壤作为参照，验证MET69对土壤速效磷的影响。土壤速效磷也称土壤有效磷，包括水溶性磷和弱酸溶性磷，速效磷容易被植物吸收利用，故其含量是判断土壤供磷能力的一项重要指标。本实施例用0.5mol/L的NaHCO₃（pH8.5）为浸提剂处理土壤，浸出液的含磷量采用钼锑抗比色法（GB 11893-89）测定。

将MET69在牛肉膏蛋白胨液体培养中活化10h后，收集菌体并用无菌水清洗1次，再用无菌水调OD₆₀₀至1.0，此时菌浓度约3×10⁸cfu/mL。每100g土样添加10mL的MET69菌液并搅拌均匀，置于自然环境下并于0h，24h，48h，72h分别取样。

称取通过1mm筛孔的风干土样5.00g置于250ml三角瓶中，加入一小勺无磷活性炭和0.5mol/L的NaHCO₃（pH8.5）浸提液100ml，塞紧瓶塞于剧烈震荡30min，取出后立即用干燥漏斗和无磷滤纸过滤，滤液用另一只三角瓶盛接。取10mL滤液用钼锑抗比色法测定磷浓度，代入公式计算对应的土壤速效磷含量，结果见表2。

土壤速效磷含量（mg/kg）=

注：

表2 MET69在72h内对土壤有效磷含量的影响

由表2可知，供试土壤原本的供磷能力较低，但在将MET69菌剂施用于土壤72h后，供试土壤中速效磷含量明显提高，供磷能力呈中等偏上水平，说明MET69是良好的土壤改良剂，能够促进土壤及时为植物补充磷素，对减少化学肥料的施用，降低农业成本，实现对土壤环境的生物修复具有重要意义。

序列表

<110>湖北大学

<120>一株高效除磷和降解卵磷脂的假单胞菌

<160>3

<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400>1

ggcctgcagg tcgacgattg gttaccttgt tacgacttca ccccagtcat gaatcactcc 60

gtggtaaccg tcccccttgc ggttagacta gctacttctg gagcaaccca ctcccatggt 120

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gtgacattct gattcacgat 180

tactagcgat tccgacttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccggac tacgatcggt 240

tttatgggat tagctccacc tcgcggcttg gcaacccttt gtaccgacca ttgtagcacg 300

tgtgtagccc tggccgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt 360

tgtcaccggc agtctcctta gagtgcccac ccgaggtgct ggtaactaag gacaagggtt 420

gcgctcgtta cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc 480

acctgtgtct gagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctca gcatgtcaag 540

gccaggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 600

cccccgtcaa ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtcgacttat 660

cgcgttagct gcgccactaa gatctcaagg atcccaacgg ctagtcgaca tcgtttacgg 720

cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagtgtcag 780

tatcagtcca ggtggtcgcc ttcgccactg gtgttccttc ctatatctac gcatttcacc 840

gctacacagg aaattccacc accctctacc gtactctagc tcagtagttt tggatgcagt 900

tcccaggttg agcccgggga tttcacatcc aacttgctga accacctacg cgcgctttac 960

gcccagtaat tccgattaac gcttgcaccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt 1020

tagccggtgc ttattctgtt ggtaacgtca aaacagcaag gtattaactt actgcccttc 1080

ctcccaactt aaagtgcttt acaatccgaa gaccttcttc acacacgcgg catggctgga 1140

tcaggccttc gcccattgtc caatattctc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg 1200

tgtctcagtt ccagtgtgac tgatcatcct ctcagaccag ttacggatcg tcgccttggt 1260

aggcctttac cccaccaact agctaatccg acctaggctc atctgatagc gtgaggtccg 1320

aagatccccc actttctccc tcaggacgta tgcggtatta gcgcccgttt ccggacgtta 1380

tcccccacta ccaggcagat tcctaggcat tactcacccg tccgccgctg aatccaggag 1440

caagctccct tcatccgctc gacttgcatg tgttaggcct gccgccagcg ttcaatctga 1500

gccaggatca aactctaatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca 1560

gttttc 1566

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19