一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法与流程

本发明涉及一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术：

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，ferulic acid esterase，FAE)又称为肉桂酸酯酶，属羧酸酯水解酶的亚类之一，是指能够水解植物细胞壁中多糖与阿魏酸连接的酯键，释放出游离的单体阿魏酸或阿魏酸二聚体。1991年，首次从橄榄色链霉菌(Streptomyces olitrochromogenes)中分离得到阿魏酸酯酶，目前已有超过30种阿魏酸酯酶被分离和纯化。阿魏酸酯酶来源广泛，普遍存在于真菌、细菌、植物中，绝大多数阿魏酸酯酶是从真菌尤其是曲霉菌属(Aspergillus sp.)中分离得到，如黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、泡盛曲霉(A.awamori)和构巢曲霉(A.nidulans)等。然而，由于大多数野生菌株产阿魏酸酯酶能力很低，如黑曲霉发酵后酶活仅在10-96mU/mL之间，这就限制了该酶的产业化应用。

基因的外源表达可以实现目的蛋白的高效生产。很多科研工作者将不同来源的阿魏酸酯酶基因导入适宜的表达体系中，以构建高产阿魏酸酯酶的重组工程菌。2001年，Juge等在毕赤酵母中实现了黑曲霉阿魏酸酯酶基因的异源高效表达，重组阿魏酸酯酶表达量为300mg/L。在国内，张帅兵等将黑曲霉阿魏酸酯酶基因导入毕赤酵母GS115中，分泌表达的重组阿魏酸酯酶酶活达16.6U/mL。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供含有所述基因的载体或细胞系。

本发明的第三个目的是提供所述基因编码的阿魏酸酯酶。

本发明的第四个目的是提供一种产阿魏酸酯酶的基因工程菌，是以pPICZαA为载体，以毕赤酵母X-33为宿主，表达所述阿魏酸酯酶基因。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，再转化至宿主细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述载体是pPICZαA。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主是毕赤酵母X-33.

本发明的第六个目的是提供一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法，是将基因工程菌接种至BMMY培养基中，200～280rpm培养3～8d。

在本发明的一种实施方式中，所述BMMY培养基每L含有：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10^-4g生物素，100mM pH 6.0磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括每20～24h补充终浓度为10mL/L的甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以活化后的菌体进行接种；所述活化是在BMGY培养基中进行。

在本发明的一种实施方式中，所述活化是将菌体接种于BMGY培养基中，于250-300rpm，30℃培养16-18h，至OD₆₀₀达到2.0-6.0，离心菌体并用BMMY培养基将菌体沉淀重悬，使菌体的OD₆₀₀为1.0，进行接种。

本发明还提供所述阿魏酸酯酶在食品、保健品、医药、化工领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备具有药用价值和保健功能的游离阿魏酸，制备功能性的食品，制备抗氧化剂、香精、香料。

有益效果：本发明提供了一种阿魏酸酯酶基因及高效表达阿魏酸酯酶的工程菌，利用本发明的优化方法构建的工程菌，均具有高效的表达能力，分泌表达的阿魏酸酯酶的酶活最高可达39.9U/mL，为今后工业化生产高活性的阿魏酸酯酶提供了思路和方法。

附图说明

图1为AnfaeA基因的琼脂糖电泳检测图；M，marker；1,基因opAnfaeAI；2，基因opAnfaeA II；

图2为pMD19-AnfaeA双酶切的琼脂糖电泳检测图；M,marker；1，pMD19-AnfaeA双酶切产物；

图3为SDS-PAGE电泳图谱；M，marker；1，FaeA-opt I；2，FaeA-opt II；

图4为FaeA-ori、FaeA-opt I和FaeA-opt II三株重组菌诱导发酵生产reAnfaeA的效果。

具体实施方式

PDA平板培养基：去皮土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然

改良马丁培养基(每L含有)：蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，pH6.4±0.2。

LB培养基(每L含有)：蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，NaCl 10g。

YPD培养基(每L含有)：蛋白胨20g，酵母浸出粉10g，葡萄糖20g。

BMGY培养基(每L含有)：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4g YNB，4×10^-4g生物素，100mM pH 6.0磷酸盐缓冲液，10mL甘油。

BMMY培养基(每L含有)：10g酵母提取物，10g蛋白胨，13.4gYNB，4×10^-4g生物素，100mM pH 6.0磷酸盐缓冲液，10mL甲醇。

阿魏酸酯酶的酶活测定方法：以阿魏酸甲酯为底物，配置标准酶活反应体系：移取900μL阿魏酸甲酯(1mmol/L，pH6.0的磷酸盐缓冲液配制)于1.5mL EP管中，50℃保温5min，加入100μL适当稀释的酶液，准确反应10min后加入400μL冰乙酸终止反应，过膜(水系，0.22μ.)，用高效液相色谱法测定经reAnfaeA水解所产生的阿魏酸的含量。以预先在酶溶液中加入400μL冰乙酸，再加底物溶液的反应物为对照。

酶活定义：每分钟降解阿魏酸甲酯生成1μmol阿魏酸所需的阿魏酸酯酶的酶量定义为一个酶活力单位U。

表1.引物、序列及酶切位点

实施例1

将黑曲霉(Aspergillus niger)CBS 513.88在PDA平板培养基上划线活化，28℃培养7～14d收集上层孢子至生理盐水中，振荡，制成孢子悬液，取菌悬液接种至改良马丁培养基中，摇床上150rpm，28℃培养3d后纱布过滤培养液搜集白色菌丝体；采用无菌生理盐水冲洗2-3次，12000rpm离心10min，吸取上清液，底部菌丝体收集备用。

将菌丝体用5mL研磨器液氮研磨过后，放入灭菌的2mL微量离心管中。使用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取黑曲霉基因组，方法见试剂盒说明书。

设计引物(表1)，以提取的A.niger染色体基因组为模板，用表1中的引物组合(F1+R1，F2+R2)分别扩增外显子1和外显子2，PCR反应条件如下：95℃4min预变性后95℃15s，52℃15s，72℃30s共进行30个循环，最后72℃延伸10min。胶回收PCR产物外显子1和外显子2。以外显子1和2的胶回收产物的混合物(1∶1)为模板，以F1和R2为上、下游引物，进行重叠延伸PCR，反应条件除了延伸时间改成60s外，其余条件均和外显子1扩增的条件相同。胶回收重叠延伸PCR产物。并连接pMD19-T载体，保存到E.coli JM109中，在含有50μg/mL氨苄的LB平板上37℃培养1-2d，挑选阳性转化子PCR验证后获得重组质粒pMD19-AnfaeA，由上海生工进行测序，基因序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

对SEQ ID NO.1所示基因进行随机突变，获得序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示基因opAnfaeAI和opAnfaeAII。将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示基因与载体pMD19-T连接，获得质粒pMD19-opAnfaeAI和pMD19--opAnfaeA II。

分别将重组质粒pMD19-AnfaeA、pMD19-opAnfaeA I和pMD19-opAnfaeA II用EcoR I和Not I双酶切后，与经相同酶双酶切的pPICZαA质粒连接。酶切体系如表2：

表2酶切体系

37℃酶切5h或37℃过夜。琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果后，胶回收酶切目的片段及载体片段。

将目的基因与pPICZaA质粒双酶切后回收片段按如表3的连接体系进行连接：

表3连接体系

16℃保温过夜，转化至E.coli JM109中，挑选阳性转化子，经PCR验证，获得重组表达载体pPICZαA-AnfaeA(图3)、重组表达载体pPICZαA-opAnfaeA I和pPICZαA-opAnfaeA II。

将3种重组质粒经Sac I酶切线性化，电转入P.pastoris X-33，涂布于，含150μg/mLZeocin的YPD平板上30℃培养3-5d，挑取单克隆进行PCR验证(引物为Opt I-F，Opt I-R，Opt II-F，Opt II-R，PCR扩增条件与实施例1中PCR反应条件相同)，阳性转化子经发酵及甲醇诱导，将发酵液离心后加到阿魏酸乙酯筛选平板上30℃孵育1h，根据透明圈大小初步筛选高酶活转化子，进一步用高效液相色谱法测定高酶活转化子所对应的发酵液上清中重组阿魏酸酯酶酶活，筛选酶活最高的阳性转化子。

实施例3

上述筛选和鉴定表达阿魏酸酯酶量的菌株的方法为：

将3种基因工程菌分别按下述方式培养：将基因工程菌单菌落接种于BMGY培养基中，于250-300rpm，30℃培养16-18h，至OD₆₀₀达到2.0-6.0；3000rpm离心5min，用5mL BMMY培养基将菌体沉淀重悬，使菌体的OD₆₀₀为1.0，再转移至等体积的BMMY培养基中，30℃、250rpm培养5d，每24h补充甲醇使其终浓度为1％(按体积比)。诱导表达结束后取样测定酶活，对表达蛋白进行10％SDS-PAGE电泳分析，得到分子量约33kDa的单一条带，表明重组工程菌表达了阿魏酸酯酶。

对发酵液中的酶活进行检测，结果显示，用浓度为1％的甲醇分别诱导重组毕赤酵母菌株FaeA-ori，FaeA-opt I，FaeA-opt II每隔12h取样，离心并测定发酵液上清的酶活。如图4所示，在发酵4.5d时比酶活最高，FaeA-ori为6.8U/ml，菌株FaeA-opt II酶活为5.2U/ml，仅为对照菌株酶活的76.5％，菌株FaeA-opt I酶活达到39.9U/ml，与对照菌株相比酶活提高了近6倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高阿魏酸酯酶酶活的方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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tcccaagccg cctacgccga cctatgcaat attccatcga ctattatcaa aggagagaaa 120

atttacaacg ctcaaactga tatcaacgga tggatcctcc gcgacgacac cagcaaagaa 180

attatcaccg tcttccgtgg cactggcagt gacacaaacc tacagctcga tactaactac 240

acgctcacgc cattcgacac tctacctcaa tgcaacgatt gcgaggtaca cggtggatac 300

tatattggat ggatctcagt ccaagaccaa gtcgagtcgc ttgtcaaaca acaggctagc 360

cagtatccgg actatgcgct taccgtgaca ggccatagtc tgggagcgtc gatggcagca 420

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