一种水溶性碳苷香豆素荧光探针、合成方法及应用与流程

本发明涉及一种水溶性碳苷香豆素荧光探针及其制备方法和应用，具体的说，涉及一种含有香豆素结构的糖碳苷类荧光探针化合物、合成方法及其在检测牛血清蛋白方面的应用。

背景技术：

最近，生物大分子和小分子之前的相互作用吸引了越来越多人的注意。在这些生物大分子中，血清蛋白是动物循环系统中最丰富的蛋白质。低的血清蛋白会导致肝脏和肾脏的损伤，饮食中低的蛋白摄取量也会导致人营养不良。因此，通过检测血液或者其它生命中血清蛋白的含量可以获得病人的健康信息，是重要的方法。牛血清蛋白是血浆蛋白的主要含量之一，且易得、廉价、稳定、以及与人血清蛋白的结构同源性，因而受到了广泛研究。通过适当的方法来确定牛血清蛋白的含量是一项重要的课题。在所有的检测方法中，荧光探针由于其高灵敏性和高选择性脱颖而出。因此，开发新的荧光探针用于检测各种蛋白越来越受到广泛关注。

碳水化合物是一类具有好的水溶液和生物相容性的生物分子，许多文献报道从糖出发设计合成离子探针、蛋白相互作用体、以及生物造影等。其中碳苷是碳水化合物一类比较稳定的糖类分子。香豆素类化合物对环境的极性较敏感，且极性探针分子由于疏水作用一般都有明显的荧光光信号响应。2014qianjunhong(dyespigments,2014,103:1-8)报道了基于香豆素的探针分子，研究了共轭体系、取代基和溶剂极性对探针光谱性质的影响，并考察了化合物对牛血清白蛋白的检测效果。其中通过将对位取代苯共轭连接到极性敏感的荧光团香豆素上，对bsa具有较高的选择性和检测灵敏度，其对bsa的线性检测范围为0-2.0mg/ml，检测限为0.6μg/ml。但是该类分子具有水溶性差，生物相容性差等缺点。

为了克服以上水溶性和生物相容性等方面的不足，我们课题组已经开发了多种水溶性糖类小分子探针，将罗丹明与糖通过席夫碱(spectroscopyletters,2015,48:578-585)或者硫脲(spectrochimicaactaparta:molecularandbiomolecularspectroscopy2017,173:495-501)相连，可用于选择性的检测水中汞离子，与汞离子结合后会引起荧光增强和紫外吸收增强。另外我们也报道了以葡萄糖为底物，两步反应构建了新型碳苷荧光分子(rscadv，2016，6：18357-18363)，实现对牛血清蛋白的检测，增加糖类结构，进一步增加了探针的水溶性和生物相容性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种水溶性碳苷香豆素荧光探针及其制备方法。

本发明的另一目的是将这一种荧光探针应用于牛血清蛋白的检测。

实现本发明的技术解决方案是：一种水溶性碳苷香豆素荧光探针，所述荧光探针具有如下结构：

一种水溶性碳苷香豆素荧光探针的合成方法，包括如下步骤

将化合物2溶二氯甲烷中，依次加入吡咯烷和7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛，室温搅拌18-24h，tlc跟踪至反应完全后，减压旋去溶剂，加入乙酸乙酯和水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，后过滤浓缩，粗产品通过柱层析分离提纯，得到目标化合物，其中化合物2的结构式为：

进一步的，柱层忻中，洗脱液采用体积比为etoac:pe10∶1～5∶1的混合物。

进一步的，化合物2和7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛的摩尔比为1∶1.2，吡咯烷的用量为化合物2的5mol％。

上述合成的水溶性碳苷香豆素荧光探针在牛血清蛋白检测中的应用。

本发明具有以下明显优点：(1)该荧光化合物有着良好的水溶性。(2)该荧光化合物对牛血清蛋白具有明显的选择性，灵敏度高，反应时间短。(4)该荧光化合物的ph适用范围较宽，为3-9。

附图说明

图1水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3对不同溶剂的紫外光谱图。

图2水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3对不同溶剂的荧光光谱图。

图3水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3的牛血清蛋白检测。

图4水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3检测牛血清蛋白的线性图。

图5ph对水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3检测牛血清蛋白的影响。

图6水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3的粒径图。

图7水溶性碳苷香豆素荧光探针化合物3加入牛血清蛋白后的粒径图。

具体实施方式

以下提供本发明一种水溶性碳苷香豆素荧光探针的合成及其在牛血清蛋白检测方面的应用测试。

本发明化合物的合成路线如下，首先以d-葡萄糖(1)为原料，合成相应的呋喃型碳苷(2)，再与7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛反应合成目标探针分子3。

实施例1

化合物2的制备

将d-葡萄糖和乙酰丙酮溶于50ml水中，加入cocl2，加热至90℃反应8-10h。tlc显示完全反应后，加入乙酸乙酯萃取，有机相减压旋干，得到的粗产品通过重结晶得化合物2。

¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ6.57(s,1h),4.61(d,j＝6.2hz,1h),4.32(t,j＝4.6hz,2h),4.19(dd,j＝10.0,4.3hz,1h),3.85(dd,j＝13.0,3.7hz,2h),3.76(s,1h),2.52(s,3h),2.34(s,3h).

¹³cnmr(125mhz,cdcl3):δ193.9,158.2,149.2,121.1,108.4,75.9,73.7,72.1,70.0,28.1,13.6ppm.

anal.calcdforc11h14o5:c,58.15；h,6.43.found:c,58.22；h,6.35.

实施例2

化合物3的制备

将化合物2溶二氯甲烷中，依次加入吡咯烷和7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛，室温搅拌18-24h，tlc跟踪至反应完全后，减压旋去溶剂，加入乙酸乙酯和水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，后过滤浓缩，粗产品通过柱层析分离提纯，得到目标化合物3。。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.84(d,j＝15.1hz,1h),7.76(s,1h),7.52(d,j＝15.2hz,1h),7.33(d,j＝8.7hz,1h),6.83(s,1h),6.61(s,1h),6.50(s,1h),5.35(s,1h),4.78-4.61(m,1h),4.43(s,2h),4.27(s,2h),3.91(s,1h),3.45(d,j＝6.8hz,4h),2.58-2.55(m,4h),2.36-2.33(m,2h),2.23(d,j＝8.4hz,1h),2.01(s,1h).

¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ185.3,158.9,155.6,150.9,148.8,145.2,137.4,129.0,124.1,121.9,108.6,108.4,108.0,96,73.8,72.3,70.1,44.1,28.7,28.4,28.1,13.7,11.5ppm.

anal.calcdforc25h27no7:c,66.21；h,6.00；n,3.09.found:c,66.15；h,5.89；n,3.05.

实施例3

该荧光探针在不同溶剂中的紫外和荧光光谱。

通过检测该探针分子在不同溶剂中的紫外和发射光谱来考察溶剂极性对光物理性质的影响，如图1所示，随着溶剂极性增加，探针的紫外和发射光谱均有明显的红移现象。可以看出，探针3在不同溶剂里的stokes位移随着溶剂极性的增加而增大。如在ea中的stokes位移为59nm,而在pbs缓冲液中的stokes位移增加到了112nm。同时如图2所示，该探针在pbs缓冲溶液中，荧光几乎消失，量子产率达到最低，而在非极性溶剂中，荧光较强，这种现象可能是由于探针在不同溶剂中的堆积作用。

从结构上分析，探针均由亲水部分(糖环部分)和亲脂部分(产生荧光的共轭芳环部分)组成。在质子溶剂中，亲水部分会相互聚集，而亲脂部分会隐藏在内部，荧光光谱图中表现为荧光淬灭。而相反，在非质子溶剂中，亲脂部分会相互聚集，而亲水部分会互相结合并且隐藏在内部，荧光光谱中表现为荧光增强。该探针对极性的高敏感性，对于设计检测蛋白的荧光探针是有益的，具有潜在的应用前景。

实施例4

荧光探针化合物3检测牛血清蛋白的紫外光谱图

为了探讨探针在生理条件下准确测试牛血清蛋白含量的可能性，进行了牛血清蛋白滴定实验。如图3所示，在测试条件下，探针3在530nm处几乎无荧光，当牛血清蛋白加入后，荧光发生了显著增强。逐渐提高探针3溶液(20mmoll^-1，ph＝7.4)中牛血清蛋白的加入量，荧光强度逐渐增加。

如图4所示，当牛血清蛋白浓度在0-2mg/ml范围内时，探针3的荧光强度比值与牛血清蛋白浓度呈良好的线性关系(r²＝0.99492，y＝2.8727x+1.0267)，表明探针3在该范围内可用于定量检测牛血清蛋白。

实施例5

ph对荧光探针化合物3检测牛血清蛋白的影响。

由于ph可以影响蛋白质分子的静电势，进而影响蛋白与探针的结合。为优化实验条件，研究了溶液酸碱度(ph变化范围3-12)对探针3与牛血清蛋白结合前后的荧光强度。如图5所示，在ph＝3-9时，探针3本身，及与牛血清蛋白结合后的荧光强度均呈现微弱的变化趋势，但当ph>10时，荧光强度迅速降低。为了模拟生物体系环境，得到最大的灵敏度，本章所有的测试工作均在接近生理条件的ph＝7.4的pbs缓冲溶液中进行。

实施例6

碳苷的荧光探针化合物3加入牛血清蛋白前后的粒度分析

溶液中探针3与牛血清蛋白复合物的粒径大小可以通过dls动态光散射进行检测。我们配置牛血清蛋白和探针3的混合水溶液，牛血清蛋白水溶液，探针3水溶液，其中牛血清蛋白浓度为1.6mg/ml，探针3的浓度为5μm。从图6中可知，5μm探针3在水溶液中的平均粒径为22.7nm，牛血清蛋白和探针3复合物的平均粒径为11.2nm(图7)，牛血清蛋白在水溶液中会自发堆积，形成微粒，当向探针3中加入牛血清蛋白时，会破坏该堆积作用，形成牛血清蛋白和3的复合物，降低探针3微粒的粒径。