一种金针菇抗肿瘤水溶性组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食用菌功效成分的提取制备方法，具体涉及一种金针菇抗肿瘤水溶性 组合物的制作方法。
【背景技术】
[0002] 当前，癌症已成为人类死亡的前两位原因之一，严重危害着人类的身心健康，虽然 经过这么多年的努力，人类在与癌症的斗争中已取得了 一些可喜成绩，但要真正攻克癌症 则还有很长的路要走。而近年来，越来越多的专家、学者们将目光转到天然产物上，特别是 食药用菌上，从中找寻可以用于治疗癌症、减轻肿瘤放化疗毒副作用或增强机体免疫等功 效的成分，以之为原料开发抗肿瘤药品或保健食品，给人类的健康事业带来福音。
[0003] 金针葫[Flammulina velutipes (Curt. :Fr.) Sing.]又名冬葫、朴葫、金葫、智力葫 等，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina)、层菌纲（Hymenomycetes)、伞菌目（Agaricales)、 口蘑科（Tricholomatacea)、金钱菌属（Flammulina)。是目前人工栽培较为广泛的食用菌 之一，在国际市场上产量居食用菌前三位。现代药理研宄表明，金针菇中的多糖、三萜、蛋 白、核酸等成分，具有免疫调节，抗肿瘤、抗病毒、保肝等功效，日益成为保健品和功能性食 品等行业研宄的热点。早在上个世纪60年代，就有日本学者报道金针菇多糖对小鼠荷S180 有明显的抑制作用，随后越来越多的研宄证实金针菇有较好的抑制肿瘤作用和免疫调节作 用，其抗肿瘤作用机理主要是通过免疫调节实现的。
[0004] 中国专利CN 102416025 B《金针菇抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途》中， 采用乙醇提取金针菇中的脂溶性成分，经溶剂萃取后得到具有抗肿瘤作用的金针菇脂溶性 提取物，体外细胞实验结果表明，该提取物部位可以明显抑制人肝癌细胞（HepG2)的增殖， 具有细胞毒作用。
[0005] 中国专利CN 103054908 A《金针菇中具有抗肿瘤作用的不皂化提取物及其制法 和用途》中，采用乙醇提取金针菇子实体，提取物经萃取、皂化、再萃取得到具有抗肿瘤作用 的不皂化提取物，实验结果表明，该不皂化提取物具有体外抑制人肝癌（HepG2)、人胃腺癌 (SGC)、人胶质癌（U251)、人肺腺癌（A549)细胞生长的活性。
[0006] 中国专利CN 103272214 A《金针菇蛋白质提取物及其抗肿瘤的应用》中，金针菇子 实体粉碎后，用水浸提，提取液经硫酸铵等电点沉淀和透析纯化后，得到金针菇蛋白质提取 物。体外细胞实验证明，该提取物对人肝癌（HepG2)、人乳腺癌（MCF-7)、人肺腺癌（A-549) 细胞均有显著的抑制增殖作用，IC 5tl值皆为8 μ g/mL，该提取物可用于制备抗肿瘤或肿瘤细 胞的产品。
[0007] 以上是目前国内关于金针菇抗肿瘤方面的专利，主要是金针菇中的脂溶性成分或 水溶性成分中的蛋白质类物质，而对于水溶性成分中的其他物质，如多糖、多肽和核酸等并 未涉及，整个的金针菇水溶性组合物也未涉及。
[0008] 除了专利之外，文献中对金针菇的抗肿瘤作用也多有报道，但研宄的重点均是金 针菇水提物中的多糖部分，其他如蛋白、三萜等则没有报道。赵坤等对金针菇菌丝体进行研 宄，发现其菌丝体多糖具有较好的抑制人肝癌（Bel-7402)细胞作用。常花蕾等通过实验证 明，金针菇多糖（FVP)对小鼠 S180肉瘤、小鼠腹水型肝细胞H22有抑制作用，对治疗卵巢癌 和乳腺癌都有较好疗效。陈芝芸等报道，金针菇多糖（FVPl)对Lewis肺癌实体瘤的生长和 自发性肺转移有明显的抑制作用，并能增强和恢复Lewis荷瘤小鼠的免疫功能。吴希哲等 报道，金针菇提取物（FVE)可以抑制Heps肿瘤细胞的增值作用，并对肝脏损伤有一定的保 护作用。邹宇晓等的研宄表明，粗多糖CFVP、脱蛋白多糖DCFVP、单一多糖组分FVP23个金 针菇多糖在体外均有不同的抑制肿瘤增殖作用，它们对人肝癌细胞H印G-2的IC 5tl分别为 396. 6、1000、719. 7 μ g/mL，该研宄结果表明未经纯化处理的金针菇多糖的抗肿瘤活性比纯 化处理的好。
[0009] 通过以上专利和文献的调研可以看出，金针菇具有一定的抗肿瘤功效，其中包括 脂溶性成分中三萜和不皂化物质、水溶性成分蛋白和多糖等，都有不同程度的肿瘤抑制作 用。然而，这些报道中，有些是经过简单的提取，未经任何步骤纯化，直接拿粗提物去做药理 研宄，药效不是很理想；有些则是提取之后经复杂的分离纯化得到较纯的某一类成分，再进 行药理研宄，结果是有的纯化成分的药效提高了，但复杂的纯化工艺成本较高；有的纯化成 分的药效反而降低了。现代的药理研宄表明，天然产物中的一些中草药和食药用菌，都有较 好的抑制肿瘤作用，但具体的作用机理或者是何种物质在起作用至今困扰着我们，研宄者 们发现，真正有较好抑瘤作用的反而是一些复合成分的组合物，单一的成分反而效果不好。
【发明内容】
[0010] 本发明目的是提供一种工艺简单、高效环保的金针菇抗肿瘤水溶性组合物的制备 方法。
[0011] 本发明的技术方案为一种金针菇抗肿瘤水溶性组合物的制作方法，其要点在于它 是将鲜金针菇子实体，加水、加热浸提，冷却、过滤得粗提液，粗提液经膜分离，收集陶瓷膜 和超滤膜之间的截留部位，再经树脂脱色除杂后，收集洗脱液，并进行浓缩、干燥，得到抗肿 瘤水溶性组合物。
[0012] 具体而言一种制备上述金针菇抗肿瘤水溶性组合物的方法，包括如下步骤： 步骤1 :鲜金针菇子实体，按重量，加水，固液比为1:2-6,加热到85~100°C，常压下 浸提l_3h，冷却到室温，80-200目过滤，滤渣再以上述比例及条件重复提取一遍，冷却到室 温，80-200目过滤，合并两次滤液即为粗提液； 步骤2 :将步骤1得到的粗提液作为母液，经陶瓷膜分离，滤过液再经超滤膜分离，陶 瓷膜的孔径为〇. 05-1 μ m，超滤膜的孔径为5-20nm，得到陶瓷膜和超滤膜之间的截留液；步 骤3 :将步骤2得到的截留液，浓缩至浓度为10~30mg/mL，经填充有树脂的层析柱脱色纯 化，按体积，液固比为20-50: 1，用纯化水为洗脱液，对树脂进行洗脱，至洗脱液吸光值不变 为止，收集洗脱液，并进行浓缩、干燥，最终得到抗肿瘤水溶性组合物。
[0013] 现有技术中有将金针菇的粗提液单独经膜分离或树脂脱色除杂形成产品，并未见 报道将二者结合起来进行纯化。本发明将二者结合起来，分离纯化得到的水溶性组合物经 体外细胞实验证明对多种肿瘤细胞有很好的抑制作用。
[0014] 还可进一步将各个参数具体为： 所述步骤1中，固液比为1 :3_5,提取温度为90_100°C。
[0015] 所述步骤2中，膜分离孔径分别为：陶瓷膜的孔径为0. 1-0. 5 μπι，超滤膜的孔径为 5_10nm〇
[0016] 所述步骤2中，陶瓷膜和超滤膜之间的截留液浓缩至浓度为15-20mg/mL，树脂柱 层析中液固比为25-35:1。
[0017] 所述的树脂为DEAE-52纤维素树脂或DEAE S印harose Fast Flow (DEAE-FF)纤维 素树脂。
[0018] 本发明进一步提供了金针菇抗肿瘤水溶性组合物在制备抗肿瘤药物或保健食品、 特殊医学配方食品领域中的应用。通过体外细胞实验发现，抗肿瘤水溶性组合物（FVE)，对 人结肠癌（HCT-8)、人肝癌〇fepG2)、人胃癌（BGC-803)和人鼻咽癌（KB)肿瘤细胞都具有良 好的抑制作用，尤其对于H印G2和KB的作用最为明显，IC 5tl分别为I. 0和0. 8 μ g/mL。
[0019] 本发明的优点在于：1、采用传统的膜分离法和DEAE-52 (或DEAE-FF)树脂脱色对 金针菇水提取液进行纯化，得到具有抑瘤作用的水溶性组合物，这水溶性组合物同时含有 水溶性多糖、蛋白和核酸等物质。整个分离过程不带入任何有机溶剂，消除了有机溶剂对环 境的污染；膜分离过程和DEAE-52树脂脱色，可以最大限度地保持被分离物质的生物活性， 工艺简便、高效环保。
[0020] 2、经体外细胞实验证明，得到的金针菇水溶性组