腐食酪螨新发现过敏原基因克隆表达纯化及其应用的制作方法

技术特征：

1.一种腐食酪螨新发现过敏原Try p 35基因克隆表达纯化方法，其包括如下步骤：

1)目的基因获取

1.1)引物设计和合成

以腐食酪螨Total RNA为模板，RT-PCR扩增KX060612序列CDS区1461bp克隆至pET28a(+)载体；

1.2)反转录和PCR扩增，并使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收目的产物，命名为CTG0124-PCR；

2)基因克隆

引物设计和合成：

名称序列(5′-3′)长度(mers)CTG0124P1CACTGATGCTCGCCTGGAAG20

使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639633)，将CTG0124-PCR和Vector DNA2连接；热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。使用T7/T7terminator引物挑选阳性菌落植菌，提取阳性克隆质粒CTG0124-1，并通过验测序验证。

3)基因表达与蛋白纯化

将质粒CTG0124-1转入BL21(DE3)T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达和培养；

挑取单菌落至2mL LB/Amp(100μg/mL)培养基中，37℃O/N培养，命名为EXP0212-2，添加IPTG进行诱导，37℃培养，集菌前吸光度值为2.65；集菌后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离；

使用EXP0212-2甘油菌保进行500mL培养，以从菌体中进行目的蛋白纯化：使用GE HiTrap TALON crude，5mL TALON Superflow柱层析和；使用10倍柱体积的灭菌MilliQ H2O 50mL和10倍柱体积的Buffer A 50mL平衡树脂，流速1mL/min；上样：BufferA平衡化后上样，流速为0.5mL/min；蛋白吸附后，使用10倍体积的Buffer A 50mL清洗树脂，流速1mL/min，W1：10mL，W2：20mL，W3：20mL；蛋白溶出Elution：Buffer A 50mL、Buffer B 50mL梯度溶出，流速1mL/min，Fraction 1.1mL/tube×90tubes；

收集目的蛋白Fraction No.46～90，使用Nanodrop-100进行定量分析，获得纯化重组蛋白，蛋白纯度为99％。

2.一种腐食酪螨新发现过敏原Try p 36基因克隆表达纯化方法，其包括如下步骤：

1)目的基因获取

1.1)引物设计和合成

以腐食酪螨Total RNA为模板，RT-PCR扩增KX060615序列CDS区396bp克隆至pET28a(+)载体；

1.2)反转录和PCR扩增，并使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.9762)切胶回收目的产物，命名为CTG0071-PCR；

2)基因克隆

使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639633)，将CTG0071-PCR和Vector DNA1连接；热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.9052)中，使用T7/T7terminator引物挑选阳性菌落植菌，提取阳性克隆质粒CTG0071-1，并通过验测序验证。

3)基因表达与蛋白纯化

将质粒CTG0071-1转入BL21(DE3)T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达；

挑取单菌落至2mL LB/Amp(100μg/mL)培养基中，37℃O/N培养，添加IPTG进行诱导，37℃培养，集菌前吸光度值为2.65；集菌后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离；

使用GE HiTrap TALON crude，5mL TALON Superflow柱层析和；使用10倍柱体积的灭菌MilliQ H2O 50mL和10倍柱体积的BufferA 50mL平衡树脂，流速1mL/min；上样：Buffer A平衡化后上样，流速为0.5mL/min；蛋白吸附后，使用10倍体积的Buffer A 50mL清洗树脂，流速1mL/min，W1：10mL，W2：20mL，W3：20mL；蛋白溶出Elution：Buffer A 50mL、Buffer B 50mL梯度溶出，流速1mL/min，Fraction 1.1mL/tube×90tubes；

收集目的蛋白Fraction No.40～65，使用Nanodrop-100进行定量分析，获得纯化重组蛋白，蛋白纯度为99％。

3.一种腐食酪螨新发现过敏原Try p 28基因克隆表达纯化方法，其包括如下步骤：

1)目的基因获取

1.1)引物设计和合成

以腐食酪螨Total RNA为模板，RT-PCR扩增GenBank No.KX060611序列CDS区1980bp克隆至pET28a(+)载体；

1.2)反转录和PCR扩增，并使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code No.2270A)切胶回收目的产物；

2)基因克隆

使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639633)，将CTG0070-PCR和Vector DNA2连接；热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.9052)中，使用T7/T7terminator引物挑选阳性菌落植菌，提取阳性克隆质粒CTG0123-2，并通过验测序验证。

3)基因表达与蛋白纯化此

将质粒CTG0123-2转入BL21(DE3)T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达；

挑取单菌落至2mL LB/Amp(100μg/mL)培养基中，37℃O/N培养，添加IPTG进行诱导，37℃培养，集菌前吸光度值为2.65；集菌后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离；

使用GE HiTrap TALON crude，5mL TALON Superflow柱层析和；使用10倍柱体积的灭菌MilliQ H2O 50mL和10倍柱体积的Buffer A 50mL平衡树脂，流速1mL/min；上样：Buffer A平衡化后上样，流速为0.5mL/min；蛋白吸附后，使用10倍体积的Buffer A 50mL清洗树脂，流速1mL/min，W1：10mL，W2：20mL，W3：20mL；蛋白溶出Elution：Buffer A 50mL、Buffer B 50mL梯度溶出，流速1mL/min，Fraction 1.1mL/tube×90tubes；

收集目的蛋白Fraction No.47～69，使用Nanodrop-100进行定量分析，获得纯化重组蛋白，蛋白纯度为99％。

4.上述腐食酪螨新发现过敏原基因克隆表达纯化方法所得到的重组蛋白。

5.上述重组蛋白在制备诊断试剂中的应用，优选的，所述的诊断试剂用于腐食酪螨过敏源临床诊断。