新型糖尿病免疫调节肽‑VP肽的设计及其用途的制作方法

本发明涉及药学及医学相关领域，特别涉及糖尿病的预防和治疗；更具体地说，本发明涉及一类新型肽及其用途，以及含有该新型肽及其衍生物和类似物的药物制剂，能用于预防、治疗人糖尿病。

背景技术：

1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus，T1DM)通常表现为胰腺炎(胰岛周围单核细胞浸润)、β细胞坏死或减少(与发病时间成正相关)或炎性因子表达。T1DM主要是由自身免疫系统紊乱造成的，自身反应性T细胞和自身抗原活化B细胞扩增，从而激活自身免疫系统对胰腺β细胞进行攻击，造成胰岛素分泌不足所导致的。自身抗原免疫能够干扰MHC class II复合体与自身反应性CD4T细胞反应，使抗原特异性T细胞对组织中的自身抗原无应答，减少Langerhans胰岛炎性浸润。因此，可以通过诱导自身抗原免疫耐受或抑制免疫反应来保护β细胞，并通过C-肽衡量残余β细胞功能。

自身抗原热休克蛋白65(Heat shock protein，Hsp65)通常位于胰腺β细胞的成熟胰岛素分泌小管。DiaPep277是其上一个主要的T表位片段(原P277片段，VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED)修饰后的合成肽，是位于C末端的24个aa(437-460)。P277能够通过Toll样受体2(TLR2)受体激活抗炎效应因子使免疫反应类型偏向调节型。II期临床试验结果表明在早期T1DM中，DiaPep277能够更好的保持β细胞功能，维持C肽水平，减少外源胰岛素需求。

但也有文献表明，热休克蛋白60(Heat shock protein，Hsp60)同时也能够与血管内皮细胞上的TLR4结合，激活NF-κB通路，促进炎性基因和炎性因子表达，对血管内皮细胞造成损伤。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)病人血清中可以检测到高水平Hsp60抗体。P277肽免疫C57BL/6小鼠时也会引起严重的血管内皮损伤。此外，免疫高脂饲养新西兰大白兔时会诱发严重的动脉粥样硬化副作用，同时在动脉硬化斑块周围检测到大量P277抗体聚集，该现象表明在P277肽中，同时存在调节细胞免疫应答的T表位和引发体液免疫的B表位。

通过表位扫描技术确定出精确B表位，在最大程度保证T表位完整性和B表位空间结构的前提下，通过单个或数个氨基酸突变或删除改造B表位。确定B表位所在氨基酸序列后，将其删除后，构建出新型糖尿病疫苗肽VP能有效调节体内免疫水平，有效预防和糖尿病。更重要的是，VP调节肽能够基本上去除P277引起动脉粥样硬化的副作用，对动脉血管内皮不会再有损伤。

技术实现要素：

发明目的：

本发明的目的是提供一种新型免疫调节肽，能够在保证致动脉粥样硬化副作用消除的前提下，有效预防糖尿病。

技术方案：

本免疫调节肽VP是根据P277野生型进行改造，删除443-445位3个氨基酸“ALL”。起到消除P277致动脉粥样硬化副作用，并维持其调节体内免疫反应状态，从而保持预防和治疗糖尿病的作用。

VP：VLGGGC RCIPALDSLTPANED

P277：VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED

VP肽在预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。

含有上述氨基酸序列、通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列，及其与药物载体或相关活性物质组合而成的药物制剂在预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。

有益效果：

P277是人热休克蛋白HSP60中的一段功能性多肽，由24个氨基酸组成，序列为437VLGGGCALLRCIPALDSLTPANED460。P277中同时含有与糖尿病相关的T表位和与动脉粥样硬化有关的B表位。本发明中，VP肽将测得B表位氨基酸去除，但并未大幅度改变P277肽空间构象和生理功能，起到了略优于P277的降糖作用。

本发明的优点在于删除P277肽中443-445位的B表位相关氨基酸，构建了一种无动脉粥样硬化副作用的新型1型糖尿病预防肽。实验结果证明，VP肽免疫新西兰大白兔血脂四项指标(总胆固醇TC，总甘油三酯TG，低密度脂蛋白LDL，高密度脂蛋白HDL)降低，hs-CRP水平也明显下调。主动脉中脂类聚集现象降低，致动脉粥样硬化的副作用较P277肽显著减轻，与PBS对照组无异。同时此疫苗肽VP能够有效延迟小鼠T1DM发病，延长NOD小鼠生存时间，维持C肽水平及β细胞正常分泌功能，有效控制NOD小鼠血糖水平，并降低发病小鼠胰岛炎级别。

附图说明

图1 VP肽对低脂或高脂饲养的新西兰大白兔血清内血脂四项指标的影响

图2 VP肽对低脂或高脂饲养的新西兰大白兔血清内hs-CRP含量的影响

图3 VP肽对心脏主动脉瓣油脂聚集的影响

图4 VP肽对NOD小鼠血糖的影响；

图5 VP肽对NOD小鼠体重的影响

图6 VP肽对NOD小鼠累计发病率的影响

图7 VP肽对NOD小鼠C肽水平的影响

图8 VP肽对NOD小鼠胰岛形态的影响

具体实施方式

下面结合一些实例对发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：VP肽动脉粥样硬化的副作用评价

1、新西兰大白兔饲养及免疫

将新西兰大白兔根据饲养条件不同分为2大组，分别为低脂组(LCD)24只，高脂组(HCD)24只。低脂组始终喂养普通饲料，高脂组始终饲喂高脂饲料，直至实验结束。高脂饲料配方为在普通家兔饲料的基础上添加1％胆固醇、6％猪油和10％的蛋黄粉。两组同时分为PBS组、P277组、VP组、AP组四组，每组各6只。各组动物从第零周开始第一次免疫，共免疫四次，两次间隔4周。将P277/VP/AP溶于无菌PBS中，浓度为1mg/mL.首次免疫采用CFA作为佐剂，此后三次加强免疫以IFA为佐剂。每只家兔注射1mL(即500μg多肽/只)，皮下6点免疫。PBS对照组仅用无菌PBS溶液代替蛋白溶液，其他步骤相同。

2、新西兰大白兔血脂指标及hs-CRP水平

每四周耳动脉取血2-4mL，室温凝固20min后，3000rpm离心10min。ELISA法检测血清中TC、TG、LDL、HDL四项血脂指标。结果如图1所示，LCD组内各免疫组血脂四项指标在观测期内均无显著性差异。VP组TC和HDL水平较PBS组明显降低，而TG和LDL则较P277组明显降低。LDL/HDL平衡中P277组明显高于PBS组，存在一定程度的血脂紊乱，而VP组则与PBS组相似，均明显低于P277组，表明基本去除此副作用。

同时以双夹心ELISA法测定血清中hs-CRP水平，结果如图2所示。各组实验动物血清中hs-CRP在基础状态时均无显著性差异。16周实验期结束后，HCD+PBS组较LCD+PBS组hs-CRP含量明显升高，LCD其余各组之间差异均无统计学意义。而HCD组内，VP组较P277组hs-CRP含量明显降低。

3、新西兰大白兔主动脉瓣油脂聚集评估

心脏主动脉瓣制作4μm冷冻切片后，行油红染色，结果如图3所示。LCD组各组油红聚集程度均明显低于HCD组，仅有少量油红油滴沉积。而HCD组切片多有大量大块油红O附着。HCD组中，P277组油滴沉积严重程度明显高于VP组，主动脉瓣膜上染色明显。

实施例2：VP肽的糖尿病相关药效学评价

1、动物免疫

将25只4周龄雌性NOD/LtJ小鼠随机分为4组，AP组、VP组、P277组(阳性对照)和油剂组(空白对照)。从NOD第5周开始每两周颈部皮下给药1次，共3次，分别为第5，7，9周给药。给药前多肽溶于力保肪宁成1mg/mL，给药量80μg/只。

2、对NOD小鼠体重血糖的影响

实验开始后，每两周NOD小鼠眼眶静脉丛取血约0.5mL，用于血清收集；并测量小鼠体重。同时用血糖监测仪尾尖取血测定NOD静脉血糖浓度，直至实验结束。前三次取血均需在给药前完成，遵循先取血检测再给药的原则，每次采血点相同。血糖值达到血糖仪H1mmol/L(超过最高测量浓度)后，统一记为35mmol/L。若发病小鼠在观测期内死亡，为便于分析，其血糖及体重均在整个观测期内记为死亡前的最后一次测定值。体重实验结果如图4所示，血糖实验结果如图5所示。在小鼠血糖维持和体重控制方面，VP肽效果与P277肽相当，明显优于PBS对照组。

3、对NOD小鼠发病率的影响

观测期内，每两周动态观测所有组NOD小鼠发病状况，记录NOD小鼠发病状况和死亡时间。小鼠血糖升高后，连续两周未禁食血糖值均≥11mmol/L，并伴有三多一少“多食、多饮、多尿，体重减少”的经典糖尿病病状，即视为已发病。发病率统计结果如图6所示。VP肽和P277肽均能明显延缓NOD小鼠T1DM发病进程，且在此方面，VP肽作用更优，从而能够减轻发病程度，降低发病率。

4、对NOD小鼠血清中C肽水平的影响

每6周ELISA法检测一次小鼠血清中C肽水平，结果如图7所示。VP免疫组和P277免疫组NOD小鼠血清中C肽始终维持在较高水平，明显优于PBS组。这表明P277和VP多肽对胰岛β细胞的分泌功能有明显保护作用，其中VP又能更好地维持胰岛素正常分泌，延缓T1DM发病。

5、对NOD小鼠胰岛形态的影响

31周观测期后，处死全部小鼠并取其胰腺，福尔马林固定后HE染色，观察胰腺状态，结果如图8所示。PBS对照组胰岛几乎已经完全破坏，难以找到明晰的胰岛。仅找到数个病变疑似胰岛，均出现大量空泡，无法维持完整的胰岛形状，难以找到胰岛界限。P277组可以找到胰岛，基本可以维持胰岛正常形态，偶见空泡形成，但胰岛界限明显。VP组胰岛数量较多，胰岛形态正常，界限明显，偶见炎性细胞浸润。对照组胰岛炎性程度明显高于P277和VP组，故VP多肽可以较好的维持胰岛形态，减少炎性浸润，保护胰岛功能。