酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A及其编码基因和应用。

背景技术：

植物细胞壁呈一种复杂的网状结构，主要成分是纤维素、半纤维素、果胶和少量的结构蛋白，果胶酶则是一系列能够降解果胶类物质的酶的总称，主要存在于细菌、真菌等微生物中。多聚半乳糖醛酸酶是一种能够切割水溶性果胶类物质中多聚半乳糖醛酸主链中的α-1，4-糖苷键的主要酶类，该酶主要通过降解果胶类物质的粘度和提升其澄清度，广泛的运用于食品、纺织等工业领域。

果胶作为一种非淀粉多糖，在单胃动物营养中被认为是一种抗营养因子。因为其在细胞壁中的结构和粘度影响了果胶本身和其他营养物质的消化和吸收，因此在动物饲料中添加果胶酶可降解畜牧的生产性能以及饲料中有机物、粗脂肪、干物质、淀粉、氨基酸的消化率。在食品领域中，果汁的榨取往往由于其果皮中含有的果胶类物质使其出汁率不高，榨取后的果汁浑浊不美观等问题，利用多聚半乳糖醛酸酶的作用，则可以大大的增加其出汁率节约生产成本，同时榨取的果汁澄清度也明显增高使其具有更好的外观和口感。纺织业中，多聚半乳糖醛酸酶的采用则可以帮助棉纤维的精炼，水解棉纤维上的果胶类物质，释放非纤维素类物质。从而增强其棉纤维的湿润性且对环境的污染小。

正是由于不同工业对于多聚半乳糖醛酸酶的应用致使其对该酶的性质需求不同，因此获取具有优良酶学性质具有重大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶。

本发明的另一目的是提供编码上述酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述酸性多聚半乳糖醛酸酶的应用。

本发明从蓝状菌Talaromyces emersonii 12802中分离得到一种新的酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MHTIQPLLTYGLAVGAVLSSAAPTAVEKRASCTFTDAASAMASKTACSTITLNNIAVPAGTTLDLTGLTSGTRVIFEGTTTFGYQEWSGPLVSISGTDITVQGASGSVLDGDGARWWDGQGSNGGKTKPKFFYAHSLDSSSITGITIKNSPVQVFSIQSNNLSLTDITVDDADGDTQGGHNTDAFDIGSSTYITITNANVHNQDDCIAVNSGENIIFTGGTCTGGHGLSIGSVGGRSDNTVKNVTIEHSTVTNSQNGVRIKTVYGATGSVSEVTYSNIQMSGITNYGIVIEQDYENGSPTGTPTNGVPITDLTLNTVTGSVSSGATEIYILCGSGSCSSWTWTGVSITGGSKSTKCENVPSGVSC

其中，该酶基因编码365个氨基酸，N端前21个氨基酸为其信号肽序列“MHTIQPLLTYGLAVGAVLSSA”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的理论分子量为35.2kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2:

APTAVEKRASCTFTDAASAMASKTACSTITLNNIAVPAGTTLDLTGLTSGTRVIFEGTTTFGYQEWSGPLVSISGTDITVQGASGSVLDGDGARWWDGQGSNGGKTKPKFFYAHSLDSSSITGITIKNSPVQVFSIQSNNLSLTDITVDDADGDTQGGHNTDAFDIGSSTYITITNANVHNQDDCIAVNSGENIIFTGGTCTGGHGLSIGSVGGRSDNTVKNVTIEHSTVTNSQNGVRIKTVYGATGSVSEVTYSNIQMSGITNYGIVIEQDYENGSPTGTPTNGVPITDLTLNTVTGSVSSGATEIYILCGSGSCSSWTWTGVSITGGSKSTKCENVPSGVSC

本发明通过PCR的方法分离克隆了酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶基因tepg28a，编码基因cDNA序列全长为1095bp，具体序列为：

ATGCATACGATCCAACCTCTTCTAACCTATGGGCTGGCCGTGGGAGCTGTCCTTTCCTCAGCGGCCCCAACTGCTGTCGAGAAGCGTGCCAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCTTCTGCCATGGCAAGCAAGACAGCCTGCTCGACTATCACGCTGAACAACATTGCCGTTCCTGCTGGGACCACCTTGGACCTGACGGGCTTGACATCCGGCACCAGGGTCATCTTCGAAGGAACAACCACCTTTGGATACCAGGAATGGAGCGGTCCCCTGGTTTCTATCTCCGGCACCGATATTACCGTTCAGGGTGCTTCGGGCTCCGTGCTTGACGGTGACGGTGCCCGCTGGTGGGATGGACAGGGCAGCAATGGCGGCAAGACCAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCTTGGACTCTTCGTCCATCACTGGCATTACTATCAAGAACTCCCCTGTTCAAGTCTTCAGCATCCAGTCCAACAATTTGAGCCTGACGGATATCACCGTCGATGACGCCGATGGCGACACCCAAGGCGGCCACAATACCGACGCCTTTGATATCGGTAGCTCCACTTATATCACGATCACGAACGCTAATGTTCACAATCAGGATGACTGCATTGCAGTCAACTCAGGGGAGAACATCATCTTCACTGGCGGCACCTGCACCGGCGGCCACGGTCTCTCCATCGGCTCTGTCGGCGGCCGCTCAGACAACACCGTCAAGAACGTCACCATCGAGCACTCCACCGTGACCAACTCCCAGAATGGCGTGCGTATCAAGACCGTGTACGGCGCGACCGGCTCCGTCTCCGAAGTCACTTACTCCAACATCCAAATGTCTGGAATCACGAACTATGGCATCGTGATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCAGCCCAACTGGTACCCCGACAAACGGTGTCCCTATTACAGATCTCACTCTCAATACTGTGACTGGTAGCGTTTCGAGTGGTGCTACGGAGATTTACATTCTCTGCGGATCTGGAAGCTGCTCTAGTTGGACTTGGACGGGTGTTTCAATTACTGGTGGCTCGAAGAGCACTAAATGTGAGAATGTGCCTTCTGGAGTTTCTTGC(SEQ ID NO.4)。

其中包括信号肽核酸序列：

ATGCATACGATCCAACCTCTTCTAACCTATGGGCTGGCCGTGGGAGCTGTCCTTTCCTCAGCG(SEQ ID NO.5)。

去除信号肽编码序列的核苷酸序列为：SEQ ID NO.6

SEQ ID NO.6

GCCCCAACTGCTGTCGAGAAGCGTGCCAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCTTCTGCCATGGCAAGCAAGACAGCCTGCTCGACTATCACGCTGAACAACATTGCCGTTCCTGCTGGGACCACCTTGGACCTGACGGGCTTGACATCCGGCACCAGGGTCATCTTCGAAGGAACAACCACCTTTGGATACCAGGAATGGAGCGGTCCCCTGGTTTCTATCTCCGGCACCGATATTACCGTTCAGGGTGCTTCGGGCTCCGTGCTTGACGGTGACGGTGCCCGCTGGTGGGATGGACAGGGCAGCAATGGCGGCAAGACCAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCTTGGACTCTTCGTCCATCACTGGCATTACTATCAAGAACTCCCCTGTTCAAGTCTTCAGCATCCAGTCCAACAATTTGAGCCTGACGGATATCACCGTCGATGACGCCGATGGCGACACCCAAGGCGGCCACAATACCGACGCCTTTGATATCGGTAGCTCCACTTATATCACGATCACGAACGCTAATGTTCACAATCAGGATGACTGCATTGCAGTCAACTCAGGGGAGAACATCATCTTCACTGGCGGCACCTGCACCGGCGGCCACGGTCTCTCCATCGGCTCTGTCGGCGGCCGCTCAGACAACACCGTCAAGAACGTCACCATCGAGCACTCCACCGTGACCAACTCCCAGAATGGCGTGCGTATCAAGACCGTGTACGGCGCGACCGGCTCCGTCTCCGAAGTCACTTACTCCAACATCCAAATGTCTGGAATCACGAACTATGGCATCGTGATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCAGCCCAACTGGTACCCCGACAAACGGTGTCCCTATTACAGATCTCACTCTCAATACTGTGACTGGTAGCGTTTCGAGTGGTGCTACGGAGATTTACATTCTCTGCGGATCTGGAAGCTGCTCTAGTTGGACTTGGACGGGTGTTTCAATTACTGGTGGCTCGAAGAGCACTAAATGTGAGAATGTGCCTTCTGGAGTTTCTTGC

本发明还提供了包含上述嗜热酸性多聚半乳糖醛酸酶基因tepg28a的重组载体，其具体实施方式为：将经过三天诱导后的Talaromyces emersonii 12802的总RNA经过反转录的cDNA为模板，通过PCR的方法克隆了多聚半乳糖醛酸酶TePG28A，该基因全长1095bp，将TePG28A的氨基酸序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对后确定TePG28A是一种新的多聚半乳糖醛酸酶。

本发明还提供了包含上述酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶基因tepg28a的重组菌株，优选所述菌株为酵母菌，优选为重组菌株GS115/tepg28a。

本发明还提供了一种制备酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；

3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶TePG28A。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/tepg28a。

本发明还提供了上述酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、果汁、面包、造纸工业中应用新的多聚半乳糖醛酸酶。本发明的多聚半乳糖醛酸酶TePG28A，其具体酶学性质为：最适pH3.5，pH2.2-5之间有较高的酶活；pH稳定性好；最适温度为70℃，其在60℃处理1h能保持90％左右的酶活，具有较好的热稳定性；比活为41，786U/mg。本发明克隆表达的酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶具有高酶活，高稳定性等优势，可以适应工业生产中的高温环境，具有更好的应用前景，能有效的降解多聚半乳糖醛酸和果胶等果胶类的物质，可有效的应用于饲料、食品、纺织等工业领域。

附图说明

图1重组多聚半乳糖醛酸酶的表达和脱糖基图，其中，1泳道为TePG28A纯化并脱糖基蛋白条带、2泳道为TePG28A纯化蛋白条带。

图2重组多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的最适pH。

图3重组多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的pH稳定性。

图4重组多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的最适温度。

图5重组多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大本发明从Talaromyces emersonii 12802中分离得到一种新的酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Fermant公司。多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Talaromyces emersonii 12802培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH2.5。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1蓝状菌Talaromyces emersonii 12802多聚半乳糖醛酸酶编码基因tepg28a的克隆

提取复合物诱导了三天的蓝状菌Talaromyces emersonii 12802的总RNA并以此为模板进行反转录，根据其全基因组测序结果及其预测的成熟氨基酸序列设计特异性引物P1，P2

P1:5′-GACTACGTAGCCCCAACTGCTGTCGAGAAGCGTG-3′；

P2:5′-GTCGAATTCCTAGCAAGAAACTCCAGAAGGCACATTCTCAC-3′。

以Talaromyces emersonii 12802总cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min；然后95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约1000bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送睿博兴科生物技术有限公司测序。拼接后TePG28A的全长为1095bp，编码365个氨基酸其中包括一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为35.2kDa。

实施例2重组多聚半乳糖醛酸酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaB I+EcoR I)，同时将编码多聚半乳糖醛酸酶的基因tepg28a双酶切(SnaB I+EcoR I)，切出编码成熟多聚半乳糖醛酸酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Talaromyces emersonii 12802多聚半乳糖醛酸酶基因tepg28a的重组质粒pPIC-PG5804并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/tepg28a。

以同样方法构建含有信号肽序列的多聚半乳糖醛酸酶基因tepg28a的重组表达质粒，并获得重组重组毕赤酵母菌株。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃ 250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃ 250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。SDS-PAGE结果表明，重组多聚半乳糖醛酸酶在毕赤酵母中得到了表达。纯化后重组多聚半乳糖醛酸的比活为41，786U/mg。

实施例4重组多聚半乳糖醛酸酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH3.5，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL 0.33％多聚半乳糖醛酸，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖所需要的酶量。

实施例5重组多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的性质测定

1、重组多聚半乳糖醛酸酶TePG28A的最适pH和pH稳定性

将实施例4纯化的重组多聚半乳糖醛酸酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70℃下进行多举办糖醛酸酶活力测定。结果(图2)表明，重组酶TePG28A的最适pH为3.5。多聚半乳糖醛酸酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH3.5缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐受性。结果(图3)表明多聚半乳糖醛酸酶在pH 1.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在90％左右，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、多聚半乳糖醛酸酶的最适温度及热稳定性

多聚半乳糖醛酸酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。热稳定性测定为多聚半乳糖醛酸酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，TePG28A有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，能保持90％左右的酶活。

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 酸性嗜热多聚半乳糖醛酸酶TePG28A及其编码基因和应用

<160>6

<210> 1

<211> 365

<212> PRT

<213> 蓝状菌Talaromyces emersonii

<400> 1

MHTIQPLLTY GLAVGAVLSS AAPTAVEKRA SCTFTDAASA MASKTACSTI TLNNIAVPAG 60

TTLDLTGLTS GTRVIFEGTT TFGYQEWSGP LVSISGTDIT VQGASGSVLD GDGARWWDGQ 120

GSNGGKTKPK FFYAHSLDSS SITGITIKNS PVQVFSIQSN NLSLTDITVD DADGDTQGGH 180

NTDAFDIGSS TYITITNANV HNQDDCIAVN SGENIIFTGG TCTGGHGLSI GSVGGRSDNT 240

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GTPTNGVPIT DLTLNTVTGS VSSGATEIYI LCGSGSCSSW TWTGVSITGG SKSTKCENVP 360

SGVSC 365

<210> 2

<211> 344

<212> PRT

<213> 蓝状菌Talaromyces emersonii

<400> 2

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FGYQEWSGPL VSISGTDITV QGASGSVLDG DGARWWDGQG SNGGKTKPKF FYAHSLDSSS 120

ITGITIKNSP VQVFSIQSNN LSLTDITVDD ADGDTQGGHN TDAFDIGSST YITITNANVH 180

NQDDCIAVNS GENIIFTGGT CTGGHGLSIG SVGGRSDNTV KNVTIEHSTV TNSQNGVRIK 240

TVYGATGSVS EVTYSNIQMS GITNYGIVIE QDYENGSPTG TPTNGVPITD LTLNTVTGSV 300

SSGATEIYIL CGSGSCSSWT WTGVSITGGS KSTKCENVPS GVSC 344

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 蓝状菌Talaromyces emersonii

<400> 3

MHTIQPLLTY GLAVGAVLSS A 21

<210> 4

<211> 1095

<212> DNA

<213> 蓝状菌Talaromyces emersonii

<400> 4

atgcatacga tccaacctct tctaacctat gggctggccg tgggagctgt cctttcctca 60

gcggccccaa ctgctgtcga gaagcgtgcc agctgcacct ttaccgatgc tgcttctgcc 120

atggcaagca agacagcctg ctcgactatc acgctgaaca acattgccgt tcctgctggg 180

accaccttgg acctgacggg cttgacatcc ggcaccaggg tcatcttcga aggaacaacc 240

acctttggat accaggaatg gagcggtccc ctggtttcta tctccggcac cgatattacc 300

gttcagggtg cttcgggctc cgtgcttgac ggtgacggtg cccgctggtg ggatggacag 360

ggcagcaatg gcggcaagac caagcccaag ttcttctacg cccatagctt ggactcttcg 420

tccatcactg gcattactat caagaactcc cctgttcaag tcttcagcat ccagtccaac 480

aatttgagcc tgacggatat caccgtcgat gacgccgatg gcgacaccca aggcggccac 540

aataccgacg cctttgatat cggtagctcc acttatatca cgatcacgaa cgctaatgtt 600

cacaatcagg atgactgcat tgcagtcaac tcaggggaga acatcatctt cactggcggc 660

acctgcaccg gcggccacgg tctctccatc ggctctgtcg gcggccgctc agacaacacc 720

gtcaagaacg tcaccatcga gcactccacc gtgaccaact cccagaatgg cgtgcgtatc 780

aagaccgtgt acggcgcgac cggctccgtc tccgaagtca cttactccaa catccaaatg 840

tctggaatca cgaactatgg catcgtgatc gagcaggact acgagaacgg cagcccaact 900

ggtaccccga caaacggtgt ccctattaca gatctcactc tcaatactgt gactggtagc 960

gtttcgagtg gtgctacgga gatttacatt ctctgcggat ctggaagctg ctctagttgg1020

acttggacgg gtgtttcaat tactggtggc tcgaagagca ctaaatgtga gaatgtgcct1080

tctggagttt cttgc 1095

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> 蓝状菌Talaromyces emersonii

<400> 5

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gcg 63

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<212> DNA

<213> 蓝状菌Talaromyces emersonii

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aatcaggatg actgcattgc agtcaactca ggggagaaca tcatcttcac tggcggcacc 600

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ggaatcacga actatggcat cgtgatcgag caggactacg agaacggcag cccaactggt 840

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tcgagtggtg ctacggagat ttacattctc tgcggatctg gaagctgctc tagttggact 960

tggacgggtg tttcaattac tggtggctcg aagagcacta aatgtgagaa tgtgccttct1020

ggagtttctt gc 1032