一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法与流程

本发明属于蜜蜂病害检测领域，具体涉及一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法。

背景技术：

中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫是东方蜜蜂的重要病害，分别由（Chinese sacbrood virus,CSBV）和和东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae，Nc）引起，两种病原分布广泛，治愈难，主要以预防为主。因此，早期病害的快速和准确的诊断尤为重要，即有利于及时采取措施进行阻断病害传播，又可为选种、育种工作提供帮助。以往，两种病原检测是分开进行的，CSBV作为RNA病毒，必须先抽提RNA，反转录后，再用PCR检验（二步法），或直接用RT-PCR方法检测（一步法）。而Nc的感染检测最常用的方法则是，提取中肠组织，用显微镜检查确定，该法检测灵敏度低；亦有用提取Nc的DNA后，再用PCR检测的。但未见同时检测这两种病原的方法。因此，我们建立了高灵敏度的二重PCR检测方法，通过提取中肠组织RNA通过PCR同时检测两种病原，具有试剂用量少，且具有高灵敏度和高准确性的优点。该方法同时检测CSBV和Nc的灵敏度可分别低至6与3个拷贝。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法，通过提取中肠组织RNA通过PCR同时检测两种病原，具有试剂用量少，且具有高灵敏度和高准确性的优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测引物，所述检测中蜂囊状幼虫病引物为：CSBV-1-F：TATTCAGGGGGACGCTACAC，CSBV-1-R：GCGTGAGTTGACAGAAAATC；检测东方蜜蜂微孢子虫的引物Nc-F：GAGAGAACGGTTTTTTGTTTGAGA，Nc-R：ATCCTTTCCTTCCTACACTGATTG。

一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法，包括如下：

（1）提取样品中肠的RNA；

（2）用一步法RT-PCR，或先转录成cDNA，再行PCR的方法进行扩增；

（3）PCR反应体系25μL：模板1μL，10μmol/L所述的CSBV-1-F、CSBV-1-R引物和检测东方蜜蜂微孢子虫的引物各1μL，PCR Master Mix 12.5μL；剩余H₂O 补足；

（4）反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，72℃再延伸5 min，反应结束后；

（5）1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶染色和观察；

（6）凝胶结果判读：若出现258bp特征条带则CSBV感染阳性，有140bp的特征条带，则东方蜜蜂微孢子虫感染阳性；若无对应条带，则为阴性。

所述的引物在制备检测中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫试剂中的应用。

本发明的优点在于：

SBV（Sacbrood virus）是蜜蜂囊状幼虫病的病原，导致东方蜜蜂的发生囊状幼虫病的CSBV是SBV的一种，我国的中蜂感染普遍，并受害严重。现有CSBV的检测亦为分子检测手段，即用一步法（RT-PCR）或两步法（反转录+PCR）实现。在成年蜂中，蜜蜂微孢子虫的感染也非常普遍，Nc的常规检测法为镜检，简单快速，但精度太低；亦有提取Nc的DNA，再PCR检测的方法。但目前，未见基于RNA提取的同时检测这两种蜜蜂病原的二重PCR方法。本方法是基于RNA提取的检测法，与提取Nc的DNA的检测法有显著不同。

应用本方法，可以实现一次提取，同时进行两种病原检测的优点。而实际检测工作中，对于一只蜜蜂样本，常见的方法是，要么提取整只蜂的DNA，要么提取整只蜂的RNA，只提取其一。如果只是提取DNA，就无法进行CSBV的检测；若提取的是RNA，经反转录合成cDNA后，则要用CSBV和Nc两对引物，分别进行两次独立的PCR反应，才能实现两种病原的检测。而且，本方法提取的是中肠组织，比用于整只蜂提取的试剂耗费显著减少，反应次数又仅需一次，且检测特异性和灵敏度均与单一检测相当，因此，有明显的优点。

附图说明

图1二重PCR方法检测CSBV和Nc的特异性。M—DNA分子标准；1—CSBV无模板空白对照；2—Nc无模板空白对照；3—（CSBV+Nc）无模板空白对照；4—CSBV阳性样本；5—Nc阳性样本；6—（CSBV+Nc）二重感染阳性样本。

图2 二重PCR法检测CSBV和Nc的灵敏度。1—CSBV无模板空白对照（NTC）；2—Nc无模板空白对照；3—（CSBV+Nc）无模板空白对照；4~7—CSBV质粒的梯度稀释样本（质粒浓度依次为6.05×10²、6.05×10¹、6.05×10⁰、6.05×10^-1拷贝）+CSBV引物；8~11—Nc质粒（质粒浓度依次为2.97×10²、2.97×10¹、2.97×10⁰、2.97×10^-1拷贝）+Nc引物；12~15—CSBV（质粒浓度依次同泳道4至7）+双引物；16~19—Nc质粒（质粒浓度依次同泳道8-11）+双引物；20~23—（CSBV+Nc）质粒+双引物，其中CSBV的质粒浓度依次为6.05×10²、6.05×10¹、6.05×10⁰、6.05×10^-1拷贝；Nc的质粒浓度依次为2.97×10²、2.97×10¹、2.97×10⁰、2.97×10^-1拷贝。

图3中蜂工蜂中CSBV和Nc二重PCR检测。M—DNA Marker；1—CSBV无模板空白对照；2—Nc无模板空白对照；3—CSBV+Nc无模板空白对照；4—CSBV阳性样本；5—Nc阳性样本：6~15—蜂群中随机取的样本。

具体实施方式

实施例1

方法：

（1）设计引物；

表1引物序列

注：CSBV-1—中蜂囊状幼虫病病毒基因组（655~893 nt）；*Nc—东方蜜蜂微孢子虫16S rRNA基因，引物引自文献：FRIES I, CHAUZAT M P, CHEN Y P, et al. Standard methods for Nosema research [J]. JournalApicultural Research, 2015, 52(1): 1–28.）。

（2）获取样本的中肠；

（3）提取中肠的RNA；

（4）用RT-PCR（一步法），或先转录成cDNA，再行PCR的方法（两步法）进行扩增；

（5）PCR反应体系（25μL）：模板1μL，10μmol/L基因上游引物和下游引物各1μL，PCR Master Mix 12.5μL，H₂O 7.5μL。

（6）反应条件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，72℃再延伸5 min，反应结束后。

（7）1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶染色和观察。

（8）凝胶结果判读：若出现258bp特征条带则CSBV感染阳性，有140bp的特征条带，则东方蜜蜂微孢子虫感染阳性；若无对应条带，则为阴性。

结果分析：

本方法的高特异性。由图1可见，目的条带清晰可见，经测序验证为两种待检测病原。

本方法的高灵敏性。本方法同时检测CSBV和Nc的灵敏度可分别低至6与3个拷贝。图2中，当CSBV和Nc 的拷贝数分别低至为6和2时（第22泳道），依然能检出。图3为中蜂群中随机抽取样本进行了检测试验，除泳道7，8，10，14外，泳道6，9，11~13，15均显示不同程度的双重感染。

本方法保护范围还适用于基于RNA提取的二重检测：即提取RNA后，即可以对RNA直接进行RT-PCR检测，也可以先进反转录成cDNA，再用cDNA进行PCR扩增。

本方法保护范围还适用于所有SBV（sacbrood virus）家族的病毒（包括其它蜜蜂的囊状幼虫病毒（Sacbrood Virus），SBV泰毒株（SBV Thai strain）,SBV朝鲜毒株（SBV Korean strain）等，和蜜蜂微孢子虫（包括东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae、西方蜜蜂微孢子虫Nosema apis）的二重检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种中蜂囊状幼虫病和东方蜜蜂微孢子虫二重PCR检测方法

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