一种寨卡病毒特异性检测靶序列、质粒标准分子及其检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物领域，主要涉及一种寨卡病毒(ZIKV)特异性检测靶序列、质粒标准分子及其核酸检测试剂盒。

背景技术：

寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)是一种通过蚊虫传播的蚊媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属，1947年首次在乌干达恒河猴中分离出。寨卡病毒感染人类引起的临床表现不特异如低热，皮疹，结膜炎，关节痛等。在之后的60年里，只在亚洲和非洲部分地区有散在的人类感染寨卡病毒的报告。2007年，寨卡病毒首次在亚洲和非洲之外的地区出现并且在西太平洋雅浦岛引起流行，随后迅速扩散至太平洋其他国家。2015年，巴西确认第一例本土寨卡病毒病例，并且确认病毒在多个地区形成流行，同时，在巴西东北部伴随有婴儿小头畸形发病率的提高。流行病调查显示，婴儿小头畸形的发生与孕妇感染寨卡病毒有关。2016年1月份，中国确诊第一例输入性寨卡病毒感染患者。传播寨卡病毒的蚊种主要为伊蚊，在我国有埃及伊蚊和白纹伊蚊的广泛分布。虽然寨卡病毒还没有在我国出现流行，但是随着国际交流，旅游等的日益便利频繁，病毒很有可能会传入中国，甚至引起大流行。特别是全球气候变暖，使得伊蚊繁殖更多，分布范围更广，更加加剧寨卡病毒传播的可能性。寨卡病毒感染的早期诊断是控制病毒传播的重要措施。检测蚊媒体内携带寨卡病毒的量，知晓蚊媒对病毒的感染率、传播率和扩散率对蚊媒的防控具有关键意义。目前，人群病人诊断的措施有血清学检查，抗原测定，病毒分离和病毒核酸检测，抗原抗体检测容易与其他黄病毒属病毒引起交叉反应，病毒分离消耗时间长。因此，开发一种能早期迅速的从病人和蚊媒中检测寨卡病毒的高度灵敏、特异且价廉、易用的检测方法刻不容缓。

技术实现要素：

本发明需要解决技术方案之一是提供一种寨卡病毒特异性核酸检测靶序列。

解决上述技术问题的技术方案的如下：

构建的ZIKV特异性检测靶序列,具有SEQ ID NO：1所示碱基组成。

本发明另一目的是提供一种重组质粒或质粒标准分子或标准物质或E.coli工程菌菌株。实现上述目的的技术方案如下：

一种包含有上述任一所述ZIKV特异性检测靶序列的重组质粒或质粒标准分子或标准物质；进一步以该重组质粒转染细菌E.coli，获得能用于生产该重组质粒的工程菌菌株。

本发明的另一目的是提供ZIKV特异性核酸检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下：

一种针对SEQ ID NO：1的ZIKV特异性核酸检测试剂盒，包括有：碱基组成为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3构成的巢式PCR外引物对，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5构成的巢式PCR内引物对，以及由SEQ ID NO：6所示碱基构成的逆转录引物，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8构成的实时荧光定量PCR引物，由SEQ ID NO：9所示碱基构成的荧光定量PCR探针。

所述实时荧光定量PCR引物和荧光定量PCR探针的荧光报告基团均为FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red中的至少一种；所述实时荧光定量PCR引物和荧光定量PCR探针的荧光淬灭基团均为MGB、BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTMRQ或Lowa BlackTMFQ中的至少一种。

本发明基于大量深入的ZIKV基因组学生物信息学分析，其中结合部分核酸二级结构及功能分析，并进行数次核酸检测体系的实践性调校与优化，方获得本发明的ZIKV核酸检测体系。进一步为杜绝在核酸检测试剂潜存的阳性对照污染问题，本发明在ZIKV检测靶片段中经过优选的插入位点插入经过人工改造的内含子片段mINTRON-T，构建了可供ZIKV核酸检测用的新型标准质粒分子，其具有SEQ ID NO：1所示碱基组成。经过测试，证实本发明所构建的ZIKV特异性的核酸检测试剂盒是有效、可行、敏感特异、价廉简便的能应用媒介蚊虫等ZIKV携带情况的检测。

附图说明

图1是PR-out-F(SEQ ID NO：2)和PR-out-R(SEQ ID NO：3)引物对ZIKV病毒株PCR扩增电泳图；

其中，Lane 1：扩增条带与预期大小313bp相符。

图2是新型标准质粒分子pBmRD-T构建示意图；

其中：横向白色箭头所示为能检测ZIKV特异性巢式PCR外巢引物对(PR-out-F，SEQ ID NO：2和PR-out-R，SEQ ID NO：3)；黑色箭头所示为ZIKV特异性内巢引物对(PR-in-F,SEQ ID NO：4和PR-in-R,SEQ ID NO：5)；浅灰色箭头及黄色小图形示意为ZIKV特异性qPCR引物和探针(PR-Q-F,SEQ ID NO：7和PR-Q-R,SEQ ID NO：8，PR-Q-Pro,SEQ ID NO：9)；黑色片段示意为ZIKV病毒株扩增片段，PCR产物预期大小为313bp/261bp；深灰色片段示插入人工改造的mINTRON-T序列片段，为50bp的插入子，因而，所构建的新型标准质粒分子作为阳性参照所扩增的阳性PCR产物预期大小为363bp/311bp。该标准质粒分子一方面能较好地检测试剂体系的有效性；另一方面，能简易地自不同的分子量大小区分可能因用户的操作或环境因素的影响而出现的来自阳性对照的潜在污染情况。

图3是CR扩增产物电泳图；

其中，A：PR-Insert-F和PR-out-R对ZIKV病毒株PCR扩增产物Frag A电泳图，Lane 1：PCR产物如预期大小236bp，B：PR-out-F和PR-Insert-R对公司合成的重组质粒pUC19--B的PCR扩增产物Frag B电泳图，Lane 1：PCR产物如预期大小177bp，C：PR-out-F和PR-out-R对Frag A+Frag B连接产物的PCR扩增电泳图，Lane 1：PCR产物如预期大小363bp，D：新型标准质粒分子pBmRD-T的双酶切鉴定，Lane 1：酶切插入子片段如预期大小436bp(克隆片段363bp+质粒片段73bp)，M：DNA标准分子量。

图4是巢式PCR扩增pBmRD-T的LOD测试的电泳图；

其中，A：PR-out-F和PR-out-R对pBmRD-T的PCR扩增LOD测试，M：DNA标准分子量，Lane1-14：新型标准质粒分子pBmRD-T梯度稀释依次为10¹⁰-10⁵copies，2000copies，400copies，80copies，40copies，20copies，10copies，5copies，1copy的外巢PCR扩增，可见外巢PCR的LOD为400copies，Lane 15：空白对照；B：巢式PCR体系对pBmRD-T的LOD测试，M：DNA标准分子量，Lane 1-6：新型标准质粒分子pBmRD-T分别稀释至80copies，40copies，20copies，10copies，5copies，1copy，可见该LOD为5copies，Lane 7-8：空白对照。

图5是巢式PCR检测体系对ZIKV病毒株检测的扩增条件优化的电泳图；

其中A：外巢引物对(PR-out-F和PR-out-R)的退火温度条件优化，M：DNA标准分子量，Lane1-6：退火温度分别为51.4℃，54.6℃，59.9℃，63.1℃，64.5℃，B：内巢引物对(PR-in-F和PR-in-R)的退火温度条件优化，M：DNA标准分子量，Lane1-6：退火温度分别为51.4℃，54.6℃，59.9℃，63.1℃，64.5℃。

图6是实时荧光定量PCR检测体系对新型标准质粒分子检测的扩增曲线，从左到右的曲线代表的标准分子拷贝数为10⁷-10¹copies/μl，每个浓度3个重复孔，曲线呈“S”型，说明该试剂盒在10⁷-10¹copies/μl之间，CT值与拷贝数成线性关系。

图7是实时荧光定量PCR检测体系对新型标准质粒分子检测的标准曲线，线性方程为：Y＝-3.387LOG(x)+41.43，相关系数R²＝0.996，扩增效率为97.4％。其中Y代表Ct值，x代表标准质粒分子拷贝数。

图8是实时荧光定量PCR检测体系的检测极限(LOD)测试的扩增曲线，扩增曲线从左到右表示标准质粒分子pBmRD-T拷贝数为2000copies/μl、400copies/μl、80copies/μl、20copies/μl、1copy/μl。标准质粒分子全部表现为扩增曲线，为阳性数据，表明该检测体系的检出限可达到1copy/反应。

图9是巢式PCR检测体系对不同来源C6/36培养的ZIKV病毒液的检测的电泳图，

A：对人工感染ZIKV后的白纹伊蚊是否感染ZIKV的检测(为PCR内巢扩增片段的电泳图)M：DNA标准分子量，Lane 1-5：白纹伊蚊佛山株感染ZIKV第1天检测结果，Lane 6-10：白纹伊蚊佛山株感染ZIKV第5天检测结果，Lane 11:空白对照,Lane 12：实验室饲养白纹伊蚊佛山株(阴性对照)，Lane 13：标准质粒分子pBmRD-T阳性对照；B：对C6/36培养的ZIKV病毒液的检测，M：DNA标准分子量，Lane 1-3：C6/36培养的ZIKV第1，2，3代病毒液外巢，Lane 4-5：空白和阴性对照，Lane 6-8：C6/36培养的ZIKV第1，2，3代病毒液内巢，Lane 9：阴性对照，Lane 10：标准质粒分子pBmRD-T阳性对照。

具体实施方式

实施例一 ZIKV通用特异性核酸检测体系生物信息学筛选与设定

筛选获得NCBI收录的49条ZIKV全长，其中非洲型16条，亚洲型33条，以MEGA6、DNAMAN等生物信息学分析软件进行分析，寻找具有ZIKV特异性的保守序列区域，且排除其他物种如ZIKV宿主人、蚊，其他黄病毒属病毒核酸序列，等，初步靶向ZIKV检测的病毒靶标检测片段以及引物对，并以Beacon Designer 7.5、Oligo6等软件进行引物的设计与评价，初步设计合成后，通过初步测试，不断进行检测体系尤其是引物序列等微调，方锚定本发明ZIKV特异性核酸检测体系，其中主要引物对见表1。

表1：ZIKV核酸检测引物、逆转录引物及其标准质粒分子构建引物

备注：PR-out-F与PR-out-R为ZIKV巢式PCR检测体系的外引物对，用于检测ZIKV时的预期片段大小为313bp,PR-in-F与PR-in-R为其内引物对，检测ZIKV的预期片段大小为261bp，PR-Q-F与PR-Q-R为qPCR引物，用于检测ZIKV时的预期片段大小为107bp；为防止作为阳性对照的质粒标准分子可能存在的气溶胶污染，改造设计了一段内含子序列mINTRON-T，插入ZIKV检测靶标片段，Overlapping PCR引物对为PR-Insert-F和PR-Insert-R，因而，检测作为阳性对照的新型质粒标准分子时，PR-out-F与PR-out-R扩增获得363bp片段，进一步的PR-in-F与PR-in-R扩增获得311bp的阳性对照片段，PR-Q-F与PR-Q-R扩增获得157bp的阳性对照片段。

实施例二 ZIKV病毒分离株靶标检测片段的制备

(一)ZIKV病毒RNA提取

ZIKV病毒株为本实验室培养保存于-80℃。采用Viral RNA Mini Kit试剂盒提取病毒RNA，试剂有:carrier-buffer AVE(-20℃),AW1,AW2,AVL,AVE等。主要步骤如下：

1.取AVL 800μl加入至2mlEP管，加入8μl carrier-buffer AVE，轻柔颠倒混匀10次；

2.将200μl病毒液样本加入至EP管，涡旋15秒，混匀，裂解，室温放置10min,瞬时离心；

3.加入800μl无水乙醇，涡旋15秒充分混匀，瞬时离心；

4.取630μl上步溶液小心加入至column中；

5.离心8000rpm 1min；

6.可根据样本情况重复第4步；

7.将column放入新2ml无盖离心管中；

8.加入500μl buffer AW1；8000rpm离心，1min；将column放入新2ml无盖离心管中；

9.加入500μl buffer AW2，14000rpm离心3min；

10.将column放入新的2ml无盖离心管中，14000rpm离心1min；

11.将column放在1.5ml离心管中，加入60μl室温的buffer AVE；室温放置2min，

8000rpm离心1min。

(二)ZIKV病毒RNA逆转录

以PR-rev-1(SEQ ID NO：6,5’-AGCGTGGTGGAAACTCATGGAG-3’)ZIKV特异性的逆转录引物进行ZIKV病毒RNA的逆转录。主要试剂：dNTP Mixture(10mM each)，RNase free ddH₂O，5×PrimeScript II Buffer，RNase Inhibitor(40U/μl)，PrimeScript II RTase(200U/μl)，主要步骤如下：

ZIKV特异型逆转录引物PR-rev-1 1μl+dNTP Mixture(10mM each)1μl+ZIKV-RNA 2μl+RNase free ddH₂O 6μl，65℃保温5min后，冰上迅速冷却；再依次加入：

缓慢摇匀后，置于PCR仪42℃30min，70℃15min。

(三)ZIKV病毒靶标检测片段的PCR扩增及切胶纯化

用PR-out-F(SEQ ID NO：2)和PR-out-R(SEQ ID NO：3)引物对，扩增上述逆转录获得的ZIKV病毒分离株cDNA

PCR扩增体系

反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸8min。反应结束后，取5μlPCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1，可见获得预期大小313bp的目的片段。

(四)新型标准质粒分子Frag B的合成与PCR鉴定

将预期的新型标准质粒分子Frag B序列交予公司合成，最后公司将该片段克隆至pUC19质粒载体,该重组质粒命名为pUC19-B。以PR-out-F和PR-Insert-R对该重组质粒进行PCR鉴定。结果：PCR鉴定见图3B，可见Lane 1显示预期大小的片段177bp，序列如下：

GGAAAGCTGTGCAGCCTGTGACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCCTATAGTCAGGCCGAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACACTGAGTCAAAAGGTGAGCATGAAGTGAATTTACGAGTGTCTTCATGTATTCTATTTGTGT

实施例三检测ZIKV的新型质粒标准分子及其工程菌菌株的构建

新型质粒标准分子pBmRD-T的构建示意图见图2。如图所示，所构建的新型标准质粒分子作为阳性参照所扩增的阳性PCR产物预期大小为363bp/311bp，将有别于本发明所构建的核酸检测体系应用于ZIKV的病毒标本检测所获得病毒靶标片段大小313bp/261bp。该标准质粒分子一方面能较好地检测试剂体系的有效性；另一方面，能简易自不同的分子量大小区分可能因用户的操作或环境因素的影响而出现的来自阳性对照的潜在污染情况。

人工改造后的内含子mINTRON-T采用Overlapping PCR构建插入ZIKV病毒株来源的片段中，大小为50bp，mINTRON-T序列为AGGTGAGCATGAAGTGAATTTACGAGTGTCTTCATGTATTCTATTTGTGT。所设计的PR-Insert-F和PR-Insert-R的具体序列见表1。具体插入方案：以PR-Insert-F和PR-out-R扩增ZIKV检测靶标片段获得Frag A 236bp片段；以PR-out-F和PR-Insert-R扩增质粒pUC19-B获得Frag B 177bp片段；进一步以PR-out-F和PR-out-R扩增FragA和FragB的连接片段，即363bp的质粒标准分子的靶标检测片段，克隆鉴定后获得质粒标准分子及其工程菌菌株。具体实施步骤如下：

1.Frag A和Frag B的PCR扩增

以ZIKV检测靶标片段PCR产物为模板，PR-Insert-F和PR-out-R PCR获得Frag A 236bp，以公司合成的pUC19-B为模板，PR-out-F和PR-Insert-R PCR获得Frag B 177bp。

PCR体系：

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s,63℃退火30s,72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸8min。取5μl PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳测定,结果见图3A和B，扩增获得预期236bp和177bp的片段。进一步经过切胶纯化后的片段Frag A和Frag B应用于下一步的连接与扩增。

2.Overlapping extension PCR

拼接反应体系

反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s,68℃退火20s,72℃延伸15s，15个循环。

进一步大量扩增Frag A+Frag B的拼接片段，反应体系如下表中所述，反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s,63℃退火20s,72℃延伸15s，15个循环,72℃延伸8m。后，取5μl PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳测定，结果见图3C，获得预期363bp大小的靶检测片段。

3.新型标准质粒分子pBmRD-T和重组甘油菌T1-pBmRD-T的构建与鉴定

对363bp产物切胶回收纯化后连接进pEASY-Blunt Cloning Vector，转化Trans1-T1Phage Resistant chemically Competent Cell感受态细胞，LB Amp⁺固体培养板培养过夜；挑取单克隆菌落接种于LB/Amp+液体培养基中，37℃摇菌过夜；以试剂盒提取质粒，进一步以双酶切和测序进行重组质粒的鉴定。结果：酶切鉴定见图3D，Lane 1切出预期大小的片段436bp(克隆片段363bp+质粒片段73bp)，双向测序验证序列正确，该克隆为阳性重组质粒pBmRD-T，保存质粒pBmRD-T和重组甘油菌T1-pBmRD-T于-80℃备用。序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例四ZIKV特异性核酸检测体系的建立与标本测试

1.巢式PCR检测体系的检测极限(LOD)测试

将标准质粒分子pBmRD-T梯度稀释为10¹⁰-10⁵copies/μl,2000,400,80copy/μl，以PR-out-F和PR-out-R对pBmRD-T进行外巢PCR扩增，如图4A所示外引物对的LOD为400copies/μl,可检测到363bp的预期大小片段；进一步将pBmRD-T分别稀释至80copies/μl，40copies/μl，20copies/μl，10copies/μl，5copies/μl,1copy/μl以PR-out-F+PR-out-R/PR-in-F+PR-in-R巢式PCR体系进行测试，如图4B所示LOD可达5copies/μl，检测到311bp预期大小的靶标片段，呈现较高的敏感性。

2.巢式PCR检测体系检测ZIKV分离株的病毒来源片段的体系优化

模板选用本实验室自保存的ZIKV病毒株来源的RNA所逆转录的cDNA，PCR扩增体系如下：

PCR反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性30s,59.9-64.9℃退火30s,72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸8min。5μl PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳测定，如图5A所示：1-5退火温度分别为59.9℃，61.1℃，62.1℃，63.2℃，64.1℃，64.9℃，不同的退火温度，均能扩增获得预期313bp的片段，条带均很亮且没有拖尾，选63℃为后续检测体系中外引物对扩增时使用的优化退火温度。

进一步将外巢扩增产物313bp稀释后作为内引物对扩增退火温度的优化，主要步骤如下：

内引物对扩增体系：

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s,56.9-64.8℃退火30s,72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸8min。5μl PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳测定，如图5B所示：1-6退火温度分别为59.9℃，61.1℃，62.1℃，63.2℃，64.1℃，64.9℃，呈示均能获得预期261bp的靶标片段，所扩增条带均较亮，选用63℃为后续检测体系内引物对的优化退火温度。

3.实时荧光定量PCR检测体系的标准曲线的构建

将标准质粒分子pBmRD-T梯度稀释为10⁷-10¹copies/μl,反应体系及条件如下表，实验结果如图6所示，标准曲线即模板浓度与Ct值之间线性关系图如图7所示。由图6和图7可见，该试剂盒的在10⁷copies/μl至10¹copies/μl之间具有很好的线性关系，同时该试剂盒拟合的线性方程为：Y＝-3.387LOG(x)+41.43，相关系数R²＝0.996，扩增效率为97.4％。其中Y代表Ct值，x代表标准质粒分子拷贝数。

4.实时荧光定量PCR检测体系的检测极限(LOD)测试

将标准质粒分子pBmRD-T梯度稀释为2000copies/μl、400copies/μl、80copies/μl、20copies/μl、1copy/μl，反应体系及条件同上。实验结果参考图8，由图8可见，标准质粒分子全部表现为扩增曲线，为阳性数据，因此通过该实验表明该检测体系的检出限可达到1copy/反应。

5.巢式PCR检测体系测试

收集白纹伊蚊佛山株人工感染寨卡病毒后第1天和第5天蚊虫各5只，白纹伊蚊实验室保种佛山株品系雌蚊1只，C6/36细胞培养的ZIKV第3，4，5代病毒液，各类标本均以试剂盒提取标本总RNA，以PR-rev-1寨卡病毒特异性逆转录引物逆转录成cDNA后，以所构建并优化的巢式PCR体系进行检测测试，如图9A所示，白纹伊蚊佛山株人工感染寨卡病毒后第1天和第5天蚊虫中有检出ZIKV阳性，检出预期261bp(Lane2,3,5,7,8,9)大小的病毒来源靶标片段，而阳性参照检出标准质粒分子中设置的预期对照311bp(Lane 13)片段，阴性标本和空白对照均呈阴性。如图9B所示，C6/36细胞培养的ZIKV第3，4，5代病毒液都检测出阳性，检出预期外巢313bp(Lane 1-3)内巢261bp(Lane 6-8)大小的病毒来源靶标片段，阳性参照检出标准质粒分子中设置的预期对照内巢311bp(Lane10)片段，阴性标本和空白对照均呈阴性。

6.实时荧光定量PCR检测体系测试

以上述白纹伊蚊佛山株人工感染寨卡病毒后第5天蚊虫，白纹伊蚊实验室保种佛山株品系雌蚊，C6/36细胞培养的ZIKV第3代病毒液标本的cDNA为样本，用所构建的实时荧光定量PCR检测体系进行绝对定量检测测试。各标准品和样本CT值和拷贝数如表2所示，各CT值在18-36之间，认为所有样本都出现阳性结果，即都检测出寨卡病毒，其中C6/36细胞培养的ZIKV第3代病毒液病毒载量约为9.3*10⁵copies。

表2：荧光定量PCR检测样本结果

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。