一种基于环介导等温扩增技术检测三种肠病毒试剂盒及检测方法与流程

本发明属于常见病原菌快速检测领域，涉及一种基于环介导等温扩增技术检测三种肠病毒试剂盒及检测方法。

背景技术：

肠病毒是一类栖息于人类消化道病毒的总称，包括小儿麻痹病毒、克沙奇A病毒、克沙奇B病毒、肠病毒等，共67种类型。肠病毒引发的疾病十分广泛，不同类型的病毒可能会出现相同的症状。典型的症状包括疱疹性咽峡炎、手足口病、无菌性脑膜炎，比较严重的症状则包括心肌炎、心包膜炎、病毒性脑膜炎、肢体麻痹症，最终可能导致瘫痪甚至死亡。每年的夏季和秋季是肠病毒爆发的高峰期，容易侵犯15岁以下儿童。尤其是三岁以下的幼儿，几乎都没有肠病毒的抗体，因此是肠病毒的高危人群。

目前，国内的检测试剂盒大都只针对中枢神经系统极易感染的EV-71进行检测，而忽略了同样具有致病性的肠道病毒，如Cox A16、Cox B3等，且检测步骤繁琐，时间较长，特异性差，且需要特定的PCR仪。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于环介导等温扩增技术检测三种肠病毒试剂盒及检测方法，该试剂盒特异性好，灵敏度高，能够快速、准确的检测三种国内常见的肠病毒；检测方法简单、易操作。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于环介导等温扩增技术检测三种肠病毒试剂盒，该试剂盒包括根据肠病毒Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因特异性序列设计的LAMP引物对，每种肠病毒的引物对都分别包括两个内引物，两个外引物，以及两条用于提高扩增效率的环引物。

其中，Cox A16-VP1引物序列如下：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

Cox B3-VP1引物序列如下：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

EV71-VP1引物序列如下：

正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

试剂盒内包括：

1)LAMP反应缓冲液，共23μl，由以下组分组成：

1×Thermopol反应缓冲液，4-10U Bst 2.0DNA Polymerase，4-10U M-MuLV Reverse Transcriptase，0.8-1.6mM dNTP，2-14mM Mg²⁺，0.6-1.2M甜菜碱，0.8-1.6μM正反向内引物FIP和BIP，0.15-0.3μM正反向外引物F3和B3，0.2-0.6μM正反向环引物LF和LB，1μl指示剂；

2)阳性对照：2μl阳性模板，阳性模板为含有Cox A16、Cox B3及EV71各自VP1基因的质粒；

3)阴性对照：2μl ddH₂O；

4)待测样品检测管：盛装2μl待检测样品。

1×Thermopol反应缓冲液中包括：20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄及0.1％Triton X-100；Tris-HCl的pH为8.8。

本发明还公开了基于上述环介导等温扩增技术检测三种肠病毒试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

1)待检样品中肠病毒的提取或肠病毒RNA的提取

取咽拭子或疱渗出液，加入标本保存液中，经过10,000-12,000rpm，4℃离心10-30min，富集咽拭子或疱渗出液样本中的肠病毒；或者，利用商业化试剂盒或传统方法提取肠病毒RNA；

2)进行肠球菌的环介导等温扩增反应

首先，将提取的病毒RNA置于95-100℃金属浴中5-10min后，立即置于冰上；然后，在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板RNA，并于60-65℃水浴锅中恒温扩增45-90min；最后，放入另一个85℃水浴锅中，5-10min钟后取出进行检测；

3)显色检测

将步骤2)得到的反应产物置于500nm蓝光LED透射仪上进行检测，反应后溶液呈绿色的为阳性，若呈黄色则为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明根据肠病毒毒力基因VP1的特异性序列设计LAMP引物，能够快速准确诊断出患者是否感染肠病毒，并能直接区分是Cox A16、Cox B3和EV71。该试剂盒使用6个区域4条引物，增强了反应的特异性，同时其检测灵敏度是普通PCR扩增技术的100倍以上。而且该反应可以在恒温条件下进行，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，成本较低。在病原微生物检测方面显示出了极为广阔的前景，同时本发明所使用的指示剂直接加在反应缓冲体系中，能够在反应前判断反应缓冲液是否失效，反应后无需开盖，避免了气溶胶引起的核酸污染。本发明的试剂盒成本低廉，不含有毒试剂，提高了检测的覆盖面，从而极大的保护了实验室操作人员和患者以及环境的安全。在检测EV71的同时，可以检测如Cox A16、Cox B3等国内常见肠病毒，促进了肠病毒感染患者的精准医疗。

附图说明

图1为LAMP检测Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因引物特异性；

图2为LAMP检测Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因灵敏度。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明公开的三种肠病毒检测试剂盒，包括：

a)LAMP反应缓冲液，LAMP反应缓冲液共23μl，由以下组分组成：1×Thermopol反应缓冲液，8U Bst 2.0DNA Polymerase，6U M-MuLV Reverse Transcriptase，dNTP 1.5mM，Mg²⁺8mM，甜菜碱0.8M，正反向内引物(FIP和BIP)1.2μM，正反向外引物(F3和B3)0.25μM，正反向环引物(LF和LB)0.5μM，1μl指示剂；

其中，1×Thermopol反应缓冲液中各组分浓度分别为：20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、2mM MgSO₄和0.1％Triton X-100；

b)阳性对照管：在LAMP反应缓冲液的基础上增加2μl阳性模板，阳性模板为含有Cox A16/Cox B3/EV71各自VP1基因的质粒；

c)阴性对照管：在LAMP反应缓冲液的基础上增加2μl ddH₂O；

d)检测管：在LAMP反应缓冲液中加入2μl待检测样品；

使用上述试剂盒检测三种肠病毒，其具体方法依次包括下列步骤：

1)待检样品的富集或RNA的提取：

取咽拭子或疱渗出液，加入标本保存液中，经过10,000rpm 4℃离心20min富集咽拭子或疱渗出液样本中的肠病毒，上清中即包含病毒样本。该病毒样本可以经过100℃水浴15min后立即放入冰上，立即检测；

或使用陕西脉元生物科技有限公司Total RNA Isolation Kit试剂盒提取纯化病毒RNA，经过RNA提取试剂盒纯化的RNA可以放入-20℃保存，集中进行检测。

2)进行肠球菌的环介导等温扩增反应：

a：将待检测样品置于95℃金属浴中5min，然后立即置于冰上；

b：在装有23μL LAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，并于63℃水浴锅中恒温扩增60min；

c：放入另一个85℃水浴锅中，8min钟后取出进行检测；

3)显色检测：

将反应产物置于500nm蓝光LED透射仪上进行检测，反应后溶液呈绿色的为阳性，若呈黄色则为阴性。

实施例1：本发明试剂盒的特异性检

采用发明中的LAMP引物和试剂盒中的LAMP反应缓冲液进行特异性检测，具体方法如下：

以Cox A16(ATCC VR-1022AS/HO)、Cox B3(ATCC VR-1034AR/MK)、EV71(ATCC VR-1432)作为标准病毒株，4株肠病毒(ATCC VR-836，ATCC VR-1077，ATCC VR-755，ATCC VR-360)作为参考病毒株，并选择其他6株非肠病毒进行特异性实验。所有病毒接种于生长状况良好的大肠杆菌菌液中，37℃过夜培养。取1ml培养液，使用陕西脉元生物科技有限公司Total RNA Isolation Kit分离纯化RNA，然后置于100℃金属浴中10min，立即置于冰上，作为模板。

取2μl制备好的模板，分别加入到检测Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因的反应管中，63℃反应60min。然后85℃反应10min，终止反应。

反应结果参见图1图1中，1:Cox A16标准病毒株ATCC VR-1022AS/HO；2：Cox B3标准病毒株ATCC VR-1034AR/MK；3：EV71标准病毒株ATCC VR-1432；4-7：肠病毒参考病毒株ATCC VR-836、ATCC VR-1077、ATCC VR-755、ATCC VR-360；8：巨细胞病毒；9：单纯疱疹病毒1型；10：单纯疱疹病毒2型；11：人疱疹病毒6型；12：人双埃可病毒；13：水痘带状疱疹病毒；14：ddH₂O。

结果显示：本发明针对Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因所设计的LAMP引物能够特异性识别Cox A16、Cox B3和EV71，说明本发明的试剂盒在检测过程中不会出现假阳性现象。

实施例2：本发明试剂盒灵敏度检测

通过PCR扩增Cox A16、Cox B3和EV71的VP1基因序列，经过DNA凝胶回收后，酶切连接到pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞中，经过氨苄抗性平板筛选培养后，挑取阳性克隆测序验证。测序正确的克隆经过LB液体培养基的培养后，提取质粒，并测定浓度。

将质粒浓度梯度稀释为10ng/μl，1ng/μl，100fg/μl，10fg/μl，1fg/μl，0.1fg/μl，0.01fg/μl，阴性对照组为ddH₂O。

具体操作同实施例1，结果参见图2，图2中，1：10ng/μl；2：1ng/μl；3：100fg/μl；4：10fg/μl；5：1fg/μl；6：0.1fg/μl；7：0.01fg/μl；8:ddH₂O。

结果显示，本发明的引物和LAMP反应体系，可以检测到1fp/μl，在试剂操作中能够满足临床需求，且不会造成漏检而耽误病情。

实施例3：临床样本检测

取50例病人咽拭子，进行检测，具体操作同实施例1，结果表1：

表1

结果显示，本发明的试剂盒能够快速准确的检测三种肠病毒，检测结果与RT-PCR扩增的结果一致，不存在假阳性和漏检。