高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子的表达基因与应用的制作方法

本发明涉及高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子的表达基因与应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

盐渍化土壤广泛分布在世界各地，且占有着较大面积，土壤盐渍化已成为影响全球农业和环境问题的主要因素之一。高盐胁迫作为主要的环境非生物胁迫之一，成为限制农业和林业生产的主要因素。土壤中高浓度的盐离子不仅可以造成植物细胞中离子失衡，引起离子毒害，还会引起细胞水分亏缺，造成渗透胁迫，从而抑制植物的正常生长发育。

脱落酸(abscisic acid，ABA)广泛参与植物生长、发育及种子休眠等方面，同时其在响应逆境胁迫中也发挥着重要作用，是植物中重要的逆境应答激素。高盐和干旱胁迫均可造成植物体内ABA含量的增加。在上述非生物胁迫条件下，ABA可通过诱导气孔的关闭使植物蒸腾速率降低，从而减少水分蒸发；另一方面，ABA通过参与相关信号传导系统，调控逆境胁迫相关基因的表达，以达到增强植物耐逆目的。

高等植物中ABA的生物合成途径涉及3个关键的调控基因，其中9-顺式环氧化类胡萝卜素过氧化物酶基因(NCED)参与负责的反应是ABA生物合成中的关键步骤。关于NCED基因，已在多种植物中得到分离和鉴定，且相应的基因功能研究表明，NCED基因在提高植物抗逆性方面具有重要作用。目前有关植物中NCED类基因的研究主要集中在基因克隆和功能研究等方面，关于NCED基因表达的调节机制尚不清楚，而对NCED启动子的研究则更少。研究表明，基因的表达受其5′端上游启动子中所包含的顺式作用元件与其相应的反式作用因子共同调控，启动子中的顺式作用元件可与RNA聚合酶特异性结合，决定着基因的转录效率。植物启动子存在不同的转录方式，其中组成型启动子可调控基因在植物各组织中表达，而组织特异型启动子仅使目的基因在特定组织中表达，诱导型启动子则在接受特定信号刺激后才能予以表达。因此，发掘不同类型的植物启动子并深入研究对于明确基因转录调控表达模式及其调控机制具有重要意义，对通过基因工程促进外源基因的表达具有重要实用价值。例如，利用诱导型启动子有针对性的调控下游基因的表达，而尽量降低不需要蛋白或有害蛋白的表达已在众多植物中得到研究。然而，目前能够实际应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。

绒毛白蜡(Fraxinus velutina Torr.)广泛应用于盐碱地造林绿化和城市园林绿化中，具有耐盐、抗旱等多种优良特性，是我国重要的林木种质资源。

中国专利文献CN105400804A(201510970988.9)公开了一种增强绒毛白蜡耐盐性的FvNCED3基因及其应用。一种控制绒毛白蜡耐盐特性的FvNCED3基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该基因在拟南芥中过表达，发现其能增强转基因拟南芥的耐盐能力，而关于绒毛白蜡NCED基因启动子的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子的表达基因与应用。

一种高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种重组质粒的构建方法，将上述高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子插入pMD18-T质粒，经BamH I和Nco I限制性内切酶酶切后插入pCAMBIA3301载体，制得重组质粒。

上述构建方法制备的重组质粒。

一种重组植物，转化了上述重组质粒。

上述高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子、重组质粒在培育耐盐植物中的应用。

本发明首次从绒毛白蜡中克隆了与脱落酸(abscisic acid，ABA)合成途径相关的NCED基因的5’端侧翼启动子序列FvNCED3p，运用生物信息学分析发现该启动子中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、胁迫响应元件等多种顺式作用元件。并通过构建其pFvNCED3p::GUS植物表达载体，转化烟草植株，运用GUS组织化学染色法对其调控活性进行验证。结果表明，该启动子驱动的GUS酶活主要在转基因烟草幼嫩植株的叶片中表达，根中则不明显，繁殖器官中GUS染色主要集中在花药、柱头部位，花瓣中则不明显。300mM NaCl胁迫处理转基因烟草后，其叶片中GUS染色较正常生长条件下的烟草叶片蓝色明显加深，证明绒毛白蜡FvNCED3p启动子驱动的基因表达可受盐胁迫诱导。试验证明通过利用绒毛白蜡FvNCED3p启动子来提高白蜡耐盐性及其树种改良具有广泛的应用前景，同时上述结果对深入分析白蜡中NCED基因响应高盐胁迫应答机制及其信号传导所引起的ABA高水平累积的分子机制具有重要研究价值。

有益效果

本发明通过GenomeWalking方法首次从绒毛白蜡中克隆了FvNCED3基因的启子序列(FvNCED3p)，分析发现其中包含有与高盐、ABA和耐逆胁迫等相关的多种顺式作用元件，并通过农杆菌介导的遗传转化法转化烟草进行验证。本发明为明确绒毛白蜡NCED基因表达调控和应用FvNCED3p启动子提供基础与依据，为培育林木耐逆新品种奠定基础。

附图说明

图1是绒毛白蜡FvNCED3p启动子的两次PCR扩增结果；

其中：M、DL1KB Plus(0.1-10kb)；泳道1、第1次巣式PCR扩增结果；泳道2、第2次巣式PCR扩增结果；

图2是转基因植株的PCR检测图；其中：M、DL5000；泳道1、野生型烟草；泳道2～9、FvNCED3p启动子转基因烟草株系。

图3是绒毛白蜡FvNCED3p启动子转基因烟草的GUS染色；

其中：A、花的GUS染色；B、花药和柱头的GUS染色；C、正常生长条件下转基因烟草幼苗的GUS染色；D、NaCl胁迫处理后转基因烟草幼苗的GUS染色。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例

1材料与方法

1.1实验材料与菌株

将绒毛白蜡种子播种于营养土中，待其长出3～4片真叶时，取其叶片液氮中速冻备用。烟草品种SR1，大肠杆菌E.coil DH5α，农杆菌LBA4404(Agrobacterium Tumefaciens)以及表达载体pCAMBIA3301均购自北京华越洋生物科技有限公司。

1.2生化试剂及试剂盒

柱式DNA胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒以及植物基因组DNA提取试剂盒均为OMEGA公司产品。Deram TaqDNA聚合酶及限制性内切酶购自上海生物有限公司。Genome Walking试剂盒购自TaKaRa。其他化学试剂均为国产分析纯。引物合成和测序均由上海生物有限公司完成。

1.3 FvNCED3p启动子克隆

FvNCED3p启动子的克隆按照GenomeWalking试剂盒操作说明进行。具体操作方法如下：

1)引物设计

实验中所用步移引物为：

SP2O：5'–GTGAAGCTGCTTTTTGAATAAAATTCCATT–3'

SP1I:：5'–CCAAGGCCAGTGAAGCTGCTTTTT–3'

SP4O：5'–ACTTTTGTTTCTGTTTTCGCTTTTTGGAG–3'

SP3I：5'–TGTCTTTAGTTAGTGCTCGTTCGAGGTGA–3'

全长扩增引物为：

PF：BamHI 5'–GGATCCACTTTTAGAAAATTAGCATAACATGTTAAA–3'

PR：Nco I 5'–CCATGGATTTTGTGCCTAACCCAAGAACTA–3'

接头引物为：

GM-AP1：5'–GTAATACGACTCACTATAGGGC–3'

GM-AP2：5'–ACTATAGGGCACGCGTGGT–3'

2)染色体步移

采用CTAB法提取白蜡叶片DNA，按照染色体步移原理，对样品进行限制性酶切及接头连接处理。具体方法如下：

在0.5mL离心管中配制20μL反应体系如下：

DNA模板 400ng，

限制性内切酶EcoRI 2μL，

10×Reaction buffer 2.5μL，

ddH₂O加至总体积20μL；

混匀离心数秒，37℃保温5h，75℃10min灭活内切酶。之后，以上20μL混合物内再加入T4Buffer 2.5μL，T4Ligase 1μL，Adapter 1μL，ddH₂O加至总体积25μL，混匀离心数秒，4℃过夜。

以上述处理好的基因组DNA片段库为模板进行PCR反应，其中第一轮反应体系包括：

10×Dream Taq Buffer 2.5μL，

10μM特异引物0.5μL(SP1I/SP3I)，

10μM接头引物0.5μL(GM-AP1)，

10mM dNTP 0.5μL，

5U/μL Taq酶0.2μL，

ddH₂0加至总体积25μL。

反应程序：95℃预变性5min；10个循环的94℃30s，68℃30sec，72℃2min 30sec，每个循环降0.8℃；然后30个循环的94℃30s，60℃30sec，72℃2min 30sec；终延伸72℃10min。

将第1轮PCR产物稀释100倍，取其1μL作为第2轮模板，所用引物为10μM特异引物0.5μL(SP2O/SP4O)，10μM接头引物0.5μL(GM-AP2)，其余各成分同第一轮。

反应程序：95℃预变性5min；28个循环的94℃30s，58℃30sec，72℃2min 30sec；终延伸72℃10min。

将第2轮PCR产物经质量百分比浓度1％的琼脂糖凝胶电泳检测，采用柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，连于pMD18-T载体后，筛选阳性克隆并于上海生物有限公司测序，获得FvNCED3基因起始密码子上游的启动子序列，经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

1.4绒毛白蜡pFvNCED3p::GUS双元表达载体的构建

以绒毛白蜡基因组DNA为模板，进行PCR扩增，特异引物核苷酸序列如下：

PF:5’-GGATCCACTTTTAGAAAATTAGCATAACATGTTAAA-3’；

PR:5’-CCATGGTTTTTGTGCCTAACCCAAGAACTA-3’，

PCR反应体系如下，总体系25μL：

PCR反应程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；终延伸72℃10min。

获得上下游分别包含BamH I和Nco I酶切位点的FvNCED3p启动子序列。将上述PCR产物与质粒pMD18-T连接，筛选pMD18-FvNCED3p阳性克隆并测序。之后采用BamH I和Nco I限制性内切酶分别对pMD18-FvNCED3p质粒和pCAMBIA3301载体进行双酶切，T4连接酶连接后，替换载体中的CaMV35S启动子，得到pFvNCED3p::GUS重组植物表达载体。

1.5烟草转化与检测

将构建好的pFvNCED3p::GUS表达载体冻融法转化农杆菌LBA4404感受态细胞。采用农杆菌介导的叶盘转化法进行烟草的遗传转化，侵染后的烟草叶盘经MS分化培养基暗培养2～3d后，于MS筛选培养基中(含1‰浓度的Basta除草剂)诱导抗性芽的长出，待抗性芽长至足够大时，将其切下转入生根培养基培养。将生根后的幼苗移入灭菌营养土中培养直至其长大。转基因烟草采用CTAB法提取其叶片DNA，以PF和PR为引物进行PCR检测。

PCR反应体系如下，总体系20μL：

ddH₂0加至总体积20μL。

PCR反应程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环；终延伸72℃10min。

1.6转基因烟草的GUS染色

将T1代转基因烟草种子播种7d后，300mM NaCl胁迫处理24h，之后分别对正常生长条件下和盐胁迫处理后的转基因烟草幼苗进行GUS组织化学染色；此外，对培养至开花期的转基因植株进行GUS染色，以进一步明确该启动子的组织表达模式。上述GUS染色均在37℃条件下进行，染色时间24h，之后用75％乙醇脱色，直至其各组织脱至透明后，于肉眼和解剖镜下观察各组织中的GUS染色情况并拍照。

2.实验结果

2.1绒毛白蜡FvNCED3p启动子的克隆

按照GenomeWalking试剂盒操作步骤，经第1次巢式PCR扩增得到大小约为800bp的FvNCED3p启动子片段，测序获得其相应序列后，在其基础上设计新的巣式PCR引物SP3I和SP4O进行第2次巢式PCR扩增，得到大小约1100bp的FvNCED3p启动子5’端上游片段；上述PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。切胶回收上述大片段后将其连于pMD18-T载体，菌液PCR筛选阳性克隆后测序，测得其长度为1094bp，其核苷酸序列见图2。表明成功获得FvNCED3p启动子序列。

2.2绒毛白蜡FvNCED3p启动子顺式作用元件分析

将获得的FvNCED3p启动子序列通过PlantCARE进行分析，结果表明其内部含有38个TATA-box和26个CAAT-box基本调控元件，符合启动子的基本结构特征。该启动子中还含有1个可提高转录水平的5'UTR Py-rich stretch元件；较多的光响应元件，如ACE、AE-box、AT1-motif、ATCT-motif、Box 4、Box I、G-Box、GA-motif、GAG-motif、GT1-motif、LS7；还包括1个参与ABA激素反应的ABRE顺式作用元件，2个盐诱导响应相关元件GT1GMSCAM4，2个高温胁迫响应元件HSE，3个赤霉素应答元件GARE-motif和P-box，3个参与胁迫和防御应答反应的TC-rich repeats元件，1个水杨酸响应元件TCA-element。此外还包括参与玉米素代谢调节的O2-site作用元件以及1个参与调控光周期反应的circadian作用元件。分析表明绒毛白蜡FvNCED3p启动子调控的相应基因的表达可能受上述多种因素的影响。

2.3转基因烟草的鉴定

将通过Basta除草剂筛选得到的抗性烟草再生植株，生根后移入灭菌营养土中培养，植株成活后，CTAB法提取转基因烟草叶片的DNA进行PCR检测。结果如图2所示，转基因株系在1100bp左右出现与预期大小相一致的目的条带，表明外源基因已转入烟草植株中。

2.4FvNCED3p启动子的GUS活性检测

对获得的转基因烟草，采用GUS组织化学染色法检测FvNCED3p启动子驱动的GUS基因在其中的表达情况，结果如图3所示，经GUS染色后，在转基因烟草幼苗的叶片部位蓝色较为明显，而根中未见明显蓝色；此外，成熟烟草植株的繁殖器官花中也有蓝色出现，其中柱头、花药部位蓝色明显，而花瓣中不明显。表明获得的FvNCED3p启动子具有驱动GUS表达活性的能力，且在叶片中表达量相对较高。采用300mM NaCl胁迫处理转基因烟草幼苗，GUS染色发现，其叶片中GUS染色较正常生长条件下的烟草叶片蓝色明显加深，证明绒毛白蜡FvNCED3p启动子驱动的基因表达可受盐胁迫诱导。

SEQUENCE LISTING

<110> 滨州学院

<120> 高盐胁迫诱导的绒毛白蜡FvNCED3基因启动子的表达基因与应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1094

<212> DNA

<213> Fraxinus velutina Torr.

<400> 1

acttttagaa aattagcata acatgttaaa aaacaacttt taatttttca aagttctaca 60

aattgggtcc ttaatgcaat tttcgatcga atgggataag agaatttgct atgaagattt 120

gatatatatg ttgtgagttc gatgttaatc cataacaatg aacttttagt cacttgtgtg 180

tttgggaccc attcttttaa aagaatgtat tattgaatag tagattgatg gaaaatatgt 240

ggttaaaaat gaaggaaaag ttattgatgt gatggaaaat attattttat tgaagaatgt 300

gtggttgaaa atgagtggaa gaatgagaat gaaaaaaata atgtgtacca aacagaggct 360

taaacacaaa tacatcattt aatttcctag aacgagaata tgaggataac taaagtttca 420

aaaattttct tgaagtcaaa tttattttta aagatcatta gatatttaac acaaatcgta 480

gtgcgaaata aataaaggac tacaatcaat ctaaatattc caatacctat caatagtaag 540

ggctcgtttg acatagtttt caaaaattca aaaggagttt ttgagcctca aaagttattt 600

ttgaaccccg ttagattaat tttgtgaaag tgattttaat agttagaaga atttttagag 660

gaaactaatc taatgtaact tcctttgaaa gtactttcaa aatgaaaatc gcttttaaaa 720

attaatttta aaaaaaatta tgataatttt ctccaaaaag cgaaaacaga aacaaaagtc 780

acctcgaacg agcactaact aaagacaact attcctcttt gtaatcaaaa tcaatttgga 840

aaaaaaaaaa aaaagtctga tccggttcag tccggtccag tccacctcat cgtttatcca 900

acacgtggtc ttcttcaaca cgttagaagt ggacttcctt ctctgcattt ccctctatat 960

atactccaca ctctcttcct tcctcattca tcaaccaaaa tactctctct atccaaactc 1020

aaaaacagca cagcttatac acacactgaa aacacgcaat ctcactttca cttgtacaaa 1080

attgggaagc catg 1094